سنجش پارامترهای نوری، کلیات آنالیز داده، گیتینگ و پردازش داده در فلوسایتومتری

مقدمه‌ای بر سنجش پارامترهای نوری، کلیات آنالیز داده، گیتینگ و پردازش داده در فلوسایتومتری

فلوسایتومتری یک تکنیک قدرتمند در علوم زیستی است که امکان اندازه گیری همزمان چندین پارامتر نوری (اپتیکال) از جمله پراکندگی نور و فلورسانس را در سطح تک سلولی فراهم می کند. این روش به طور گسترده در ایمونولوژی، هماتولوژی، سرطان شناسی و تحقیقات پایه مورد استفاده قرار می گیرد. اینجا به بررسی اصول سنجش پارامترهای نوری، کلیات آنالیز داده، استراتژی های گیتینگ (Gating) و پردازش داده های فلوسایتومتری به صورت فنی پرداخته می شود.

1. پارامترهای نوری در فلوسایتومتری

در فلوسایتومتری، دو دسته اصلی از پارامترهای نوری اندازه گیری می شوند:

1-1- پراکندگی نور (Light Scatter)

• Forward Scatter (FSC): نور پراکنده شده در زاویه کم (۰.۵–۱۰ درجه) که نشان دهنده اندازه سلول (Cell Size) است.
• Side Scatter (SSC): نور پراکنده شده در زاویه ۹۰ درجه که نشان دهنده پیچیدگی داخلی سلول (Granularity/Internal Complexity) است.

این دو پارامتر برای تمایز جمعیت های سلولی (مثل گرانولوسیت ها، لنفوسیت ها و مونوسیت ها) بر اساس ویژگی های فیزیکی استفاده می شوند.

1-2- فلورسانس (Fluorescence)

سیگنالهای فلورسانس از طریق فیلترهای نوری و دیودهای فتومولتیپلایر (PMT) شناسایی میشوند. هر کانال فلورسانس مربوط به یک رنگ فلوروکروم خاص است که به آنتیبادیها یا نشانگرهای سلولی متصل شده است.

• طول موج های تحریک (Excitation) و انتشار (Emission) باید با فیلترهای دستگاه مطابقت داشته باشند.
• جبران طیفی (Spectral Compensation) برای اصلاح همپوشانی سیگنالهای فلورسانس ضروری است.

2-  کلیات آنالیز داده های فلوسایتومتری

دادههای فلوسایتومتری بهصورت لیستروید (List-mode Data) ذخیره میشوند و شامل مقادیر FSC, SSC و فلورسانس برای هر سلول هستند. مراحل اصلی آنالیز عبارتند از:

2-1- پیش پردازش داده (Data Preprocessing)

• حذف دِبْریس (Debris Removal): حذف ذرات غیرسلولی با گیتینگ بر اساس FSC-A vs. SSC-A.

حذف دبریس (ذرات غیرسلولی و بقایای سلولی) در فلوسایتومتری یک مرحله حیاتی است که تأثیر مستقیمی بر کیفیت و قابلیت اطمینان داده‌ها دارد. دبریس شامل ذرات کوچک، بقایای سلولی و اجزای غیرزنده است که می‌توانند به عنوان رویدادهای کاذب ثبت شده و نتایج آزمایش را مخدوش کنند. این آلاینده‌ها نه تنها دقت اندازه‌گیری‌ها را کاهش می‌دهند، بلکه ممکن است منجر به تفسیر نادرست جمعیت‌های سلولی، به ویژه در مورد جمعیت‌های نادر یا با فراوانی کم شوند.

حذف مؤثر دبریس خلوص نمونه را افزایش می‌دهد و امکان شناسایی دقیق‌تر زیرمجموعه‌های سلولی را فراهم می‌کند. این امر به ویژه در مطالعاتی که به آنالیزهای کمی حساس مانند اندازه‌گیری بیان مارکرها یا سورتینگ سلولی نیاز دارند، اهمیت دوچندان می‌یابد. علاوه بر این، حذف دبریس تکرارپذیری آزمایش‌ها را بهبود بخشیده و مقایسه‌پذیری داده‌ها بین آزمایشگاه‌های مختلف را ممکن می‌سازد.

برای دستیابی به بهترین نتایج، ترکیب روش‌های گیتینگ مناسب (مانند گیتینگ بر اساس FSC-A و SSC-A) و بهینه‌سازی شرایط نمونه‌برداری (مانند فیلتر کردن نمونه‌ها و استفاده از محلول‌های مناسب) ضروری است. در نهایت، حذف صحیح دبریس نه تنها کیفیت داده‌ها را تضمین می‌کند، بلکه از هدررفت زمان و منابع در مراحل بعدی آنالیز نیز جلوگیری می‌نماید.

• حذف دوتایی ها (Doublet Discrimination): استفاده از FSC-H vs. FSC-W یا SSC-H vs. SSC-W  برای تشخیص سلولهای منفرد.

یکی از چالش‌های اصلی در آنالیز فلوسایتومتری، تشخیص و حذف سلول‌های دوتایی (Doublets) است. دوتایی‌ها زمانی تشکیل می‌شوند که دو یا چند سلول همزمان از مقابل لیزر عبور کرده و به عنوان یک رویداد (Event) ثبت می‌شوند. این پدیده می‌تواند منجر به تفسیر نادرست داده‌ها، شناسایی اشتباه جمعیت‌های سلولی و تخمین ناصحیح فراوانی‌ها شود. در این بخش، به بررسی مکانیسم تشکیل دوتایی‌ها، روش‌های شناسایی و استراتژی‌های حذف آنها به صورت فنی پرداخته می‌شود

• نرمال سازی داده ها (Normalization): در موارد مقایسهای بین نمونههای مختلف استفاده میشود.

اصول پایه گیتینگ در فلوسایتومتری

گیتینگ فرآیند انتخاب جمعیت های سلولی بر اساس ویژگی های نوری (پراکندگی نور و فلورسانس) است. این فرآیند معمولاً به صورت سلسله مراتبی انجام می شود تا جمعیت های خالص تر استخراج شوند.

انواع گیت های پایه

الف) گیت سلولهای زنده  (Live Cell Gate)

• هدف: حذف دبریس و سلول های مرده.
• روش:
  • استفاده از رنگ های امتیاز حیاتی مانند Propidium Iodide (PI)  یا DAPI  برای سلول های مرده (PI+ یا DAPI+).
  • گیتینگ بر اساس FSC-A vs. SSC-A برای حذف ذرات کوچک (دبریس).

ب) گیت سلول های منفرد (Singlet Gate)

• هدف: حذف دوتایی ها (doublets) و تجمعات سلولی.
• روش:
  • استفاده از FSC-H vs. FSC-W (Height vs. Width):  سلول های منفرد در یک خط مورب قرار می گیرند، در حالی که دوتایی ها خارج از این محدوده هستند.
  • SSC-H vs. SSC-W  نیز برای تأیید بیشتر استفاده میشود.

ج) گیت جمعیت اصلی  (Parent Population Gate)

• هدف: جداسازی جمعیت های اصلی مانند لنفوسیت ها، مونوسیت ها و گرانولوسیت ها.
• روش:
  • FSC-A vs. SSC-A:  لنفوسیت ها معمولاً FSC متوسط و SSC کم دارند، در حالی که گرانولوسیت ها SSC  بالا دارند.

استراتژی های پیشرفته گیتینگ

1- گیتینگ چندپارامتری (Multiparametric Gating)

در فلوسایتومتری چندرنگی (مثلاً ۱۰+ رنگ)، گیتینگ باید به صورت چندمرحلهای و با در نظر گرفتن تمام مارکرها انجام شود.

• مثال: شناسایی سلول های Treg (CD4+CD25+FoxP3+)  نیازمند گیتینگ متوالی روی CD3, CD4, CD25  و FoxP3 است.

الف) گیتینگ آبشاری (Sequential Gating)

1. گیت لنفوسیت ها (FSC vs. SSC).
2. **گیت سلول های T (CD3+).
3. **گیت سلول های کمکی (CD4+).
4. **گیت Tregها (CD25+FoxP3+).

ب) گیتینگ Boolean

ترکیب گیت ها با عملگرهای AND, OR, NOT برای تعریف جمعیت های پیچیده.

• مثلاً: (CD4+ AND CD25+) NOT CD127+ برای Tregها.

2- گیتینگ مبتنی بر جمعیت های نادر  (Rare Population Gating)

برای شناسایی جمعیت های با فراوانی کم (<0.1%) مانند سلولهای بنیادی خونساز (HSCs) یا سلولهای توموری گردشی (CTCs)، روشهای خاصی نیاز است:

• استفاده از مارکرهای ترکیبی (مثلاً CD34+CD38-  برای HSCs)
• حذف سلول های غیراختصاصی با “dump channel” (مثلاً حذف تمام سلولهای CD3+CD19+CD14+).

3- ابزارهای آنالیز داده های فلوسایتومتری

3-1- نرم افزارهای گیتینگ

• FlowJo: پرکاربردترین نرم افزار با قابلیت گیتینگ پیشرفته و تحلیل چندمتغیره.
• FCS Express: دارای ابزارهای خودکار برای گیتینگ و مدل سازی داده ها.
• Cytobank: پلتفرم مبتنی بر ابر برای آنالیزهای پیچیده مانند Citrus  و SPADE

3-2- روش های یادگیری ماشین (Machine Learning)

• الگوریتم های طبقه بندی (Random Forest, SVM): برای تشخیص خودکار جمعیت های سلولی.
• تحلیل ابعاد کاهشی (PCA, t-SNE): برای تجسم داده های چندپارامتری.

4-  چالش های آنالیز داده های فلوسایتومتری

1. همپوشانی فلورسانس (Spectral Overlap): نیاز به جبران طیفی دقیق.
2. تغییرپذیری بین آزمایش ها (Batch Effects): نیاز به استانداردسازی پروتکلها.
3. داده های با ابعاد بالا (High-Dimensional Data): مشکل در تفسیر دادههای ۲۰+ پارامتری.
4. حذف نویز (Noise Reduction): تأثیر ذرات غیراختصاصی بر نتایج

همچنین بخوانید:

• دوره کارآموزی فلوسایتومتری