سمیت سنجی مواد با روش های سلولی

بررسی زنده مانی سلول ها در مجاورت مواد مختلف

تکنیک های سمیت سنجی مواد، مجموعه‌ای از تست های برون تنی می باشند که در آن مواد و ترکیبات مختلف در مجاورت سلول های تحت کشت قرار گرفته و سپس ویژگی های سلولی از نظر زنده مانی مورد بررسی قرار می گیرد. بسته به اهدافی که در ساخت یک ترکیب بیولوژیک دنبال می شود ممکن است نتیجه های متفاوتی مانند افزایش رشد، کاهش رشد، کشندگی و عدم اثر گذاری بر رشد، مورد انتظار باشد.

• آزمایشگاه ژنیران انواع تست های سمیت سنجی مواد برای رده های سلولی مختلف را به همراه تست های پایین دست و بالا دست به انجام می رساند.

تاریخچه پایه‌گذاری تست های سمیت سنجی مواد

در گذشته و قبل از به وجود آمدن سیستم های in-vitro اثر مواد و دارو های مختلف به صورت تجربی بر روی موجودات زنده کامل دنبال می شد. یعنی به عبارتی تمامی ترکیباتی که قرار بود توسط انسان ها مصرف شود، چه به عنوان دارو و چه به عنوان یک ترکیب خوراکی، بر روی حیوانات تست شده و نتایج آن مورد ارزیابی قرار می گرفت.

از طرفی دیگر بسیاری از دارو های دیگر وجود داشتند که در کتب قدیمی ارزیابی اثرات آن مستقیماً بر روی انسان انجام شده بود و گزارش شده بود. لذا اثربخشی تقریبی بخش زیادی از مواد در درمان یک بیماری و همچنین کیفیت زندگی از نظر عوارض جانبی مشخص بود اما آنچه مشخص نشده بود دز مؤثر مواد و همچنین علت و معلول گرایی در عوارض جانبی دارو ها بوده است.

از طرفی دیگر نرخ بالای کشف مواد مؤثر طبیعی و سنتز شده باعث می شد تا ارزیابی نتایج عملکردی آن ها سرعت کمتری نسبت به توسعه مواد باشد. به نظر می رسد آن چه که نقطه عطف توسعه سیستم های برون تنی بود، حرکت سریع دنیا به سمت صنعتی شدن پس از اتمام جنگ جهانی دوم بوده است.

زمانی که جنگ ویرانگر به پایان رسید و فرصت بررسی تبعات آن امکان پذیر شد، گویی همه کشور های درگیر جنگ تازه متوجه شدند که وارد چه مسیر فاجعه باری شده‌اند و تنها راه نجات و جبران مافات رو آوری به دانشگاه ها و معرفی نسل سوم از دانشگاه ها بود. در نسل سوم رویکرد استفاده حداکثری از پتانسیل های موجود در طبیعت و صنعتی شدن دانشگاه ها بود تا با این رویه دانشگاهی ها هم در تولید ثروت نقش داشته باشند.

بالا رفتن سرعت صنعتی شدن منجر به افزایش نرخ تولید علم در گوشه گوشه جهان شد. اگرچه از دهه 1910 پایه گذاری کشت سلول اتفاق افتاده و سلول های دوزیستان و پستانداران ساده‌ای مثل موش برای مدت کوتاهی در خارج از بدن آن نگهداری شد اما آن چه که باعث شد همه دانشمندان به سمت کشت سلول سوق داده شوند و از این سیستم به عنوان یک سیستم معتبر استفاده کنند، همان افزایش سرعت رشد صنایع بود.

در دهه های اولیه قرن 20، قریب به 40 سال طول کشید تا محققان فقط بتوانند یک سلول را خارج از بدن یک سیستم in-vivo برای مدت کوتاهی زنده نگه دارند. اما از میانه‌ی قرن 20 گویی همه بستر ها فراهم بودند تا سیستم in-vitro شکل گرفته و پیشرفت های مناسبی داشته باشد. توانایی کشت سلول خارج از بدن یک موجود زنده کامل، علاوه بر پتانسیل های بالایی که در زمینه های تولیدات پروتئینی، ژن درمانی، سلول درمانی و … داشت یک بستر بسیار مناسبی را برای ارزیابی اثرات ترکیبات مختلف بر روی موجودات زنده در زمان بسیار کم فراهم کرد.

از این رو تمامی ترکیبات جدیدی که به عنوان دارو ارائه می شدند یا حتی ترکیباتی که قبلا اثر مثبت آن ها دیده شده بود، مجدداً بر روی سلول های مختلف تست می شدند. تکنیک های سمیت سنجی مواد در طول 70 سال گذشته کمک شایانی به تسریع پیشرفت در صنایع مختلفی چون داروسازی، غذایی، شیمی، کشاورزی، نساجی، آرایشی و بهداشتی، الکترونیک و … کرده است.

در ادامه در رابطه با روش های مختلف سمیت سنجی مواد برای سلول ها صحبت شده و همچنین ترکیبات و موادی که می توان برای آن ها این تست ها را اجرا کرد، اشاره خواهد شد.

• در رابطه با کشت سلول و یادگیری تکنیک های مربوطه بیشتر بدانید…

تست زنده مانی سلولی یا سمیت سنجی مواد چیست؟

تمامی تکنیک های تعریف شده در حوزه زیست شناسی، همه و همه بر پایه شناختن تغییرات ایجاد شده در چند گروه متفاوت و سپس ارائه یک روش برای شناسایی آن تفاوت ها می باشد. تکنیک های سمیت سنجی مواد و بررسی زنده مانی نیز از این قاعده مستثنی نیستند.

به عبارتی محققان علوم طبیعی همیشه بر آن بوده‌اند که تفاوت های بین گروه های مختلف سلولی یا جانوری را کشف کرده و پس از بوجود آوردن یک تغییر توسط خودشان، توانایی شناسایی آن را نیز داشته باشند. زمانی که در دو گروه موجود زنده با جنس و گونه متفاوت، هدف مقایسه متابولیسم سلولی است، باید متابولیسم سلولی هر دو گروه به خوبی شناخته شده و فاکتور های متغیر حدس زده شوند.

سپس باید تکنیکی پایه گذاری شود تا توانایی تمییز قائل شدن بین این ویژگی ها بوده و بتواند آن تفاوت ها را نیز اعلام کند. در تست های سمیت سنجی مواد، مبنا زنده بودن و نبودن سلول است.

در 70 سال گذشته تکنیک کشت سلول توانسته مجموعه نامتناهی از سلول های تحت کشت را در اختیار محققان قرار دهد. لذا این سیستم سلول های را به شکل مستقیم در دسترس دانشمندان گذاشته تا بتوانند با دقت بسیار بالاتری فرآیند های سلولی و بالاخص مولکولی را در موجودات زنده بررسی کنند. در نهایت مطالعات گسترده محققین ویژگی هایی را به عنوان  gold standard تفاوت های سلول های زنده و مرده تبیین کردند.

• اولین ویژگی مطرح شده برای تفاوت های سلول زنده و مرده، متابولیسم سلولی بود. یک سلول در شرایط ایده آل متابولیسم فعالی داشته و تمامی محصولات متابولیکی آن در بالاترین سطح می باشد. یعنی از طرفی آنزیم های متابولیکی که در آنابولیسم و کاتابولیسم نقش دارند به شکل کاملا فعال در تیتر بالای خود هستند و از طرف دیگری محصولاتی که به عنوان مولکول انرژی شناخته می شوند مانند ATP، NADH و FADH₂ نیز سطح بالایی دارند. لذا این فاکتور های متابولیکی می توانند کاندید های مناسبی برای مقایسه سلول های زنده و مرده باشند.
• ویژگی دوم ساختار غشاء و تمامیت آن در سلول است. تمامیت غشاء در سلول های زنده کاملا حفظ شده تا محتویات سلولی به بیرون نشت نکرده و از طرفی مواد ناخواسته وارد سلول نشوند. اما غشاء یک سلولی که مسیر مرگ برنامه ریزی شده را در پیش گرفته پر از منافذی است که سلول را به شدت نفوذ پذیر می کند. همچنین مواد داخل سلولی به راحتی به بیرون نشت می کنند.
• ویژگی سوم ساختار DNA هسته‌ای می باشد. ساختار های کروماتینی و کروموزومی در یک سلول زنده همیشه حفظ شده است. به عبارتی انتهای آزاد DNA از نوع 3’-OH و 5’-OH فقط در انتهای کروماتین وجود دارد. اما زمانی که پروسه‌ی مرگ آغاز می شود، ساختار توالی نوکلئیک اسید شکننده شده و از نواحی مختلف شکست DNA بوجود می آید. به اصطلاح می توان گفت DNA در سلول های مرده تکه تکه شده است.
• ویژگی چهارم چرخه سلول می باشد. سلول زنده یک چرخه سلولی استاندارد با فاز های G1/G0، S، G2 و M/C دارد. فاز های مختلف چرخه سلولی با حجم DNA سنجیده می شود. سلول های سالم و استاندارد همه نسبت های مشخصی برای هر یک از فاز ها دارند اما سلول های مرده به دلیل تخریب DNA در هیچ کدام از این فاز ها نبوده و به عنوان سلول های sub-G1 در نظر گرفته می شوند.

تست های زنده مانی و سمیت سنجی مواد بر پایه متابولیسم سلولی

همانطور که پیشتر گفته شد، یکی از اصلی ترین تفاوت های بین سلول های زنده و مرده، متابولیسم سلولی می باشد که نهایتاً منجر به اختلاف انرژی سلولی می شود. بهره‌گیری از این اختلاف سطح انرژی منجر به توسعه تکنیک هایی بر پایه نمک های تترازولیوم شده است. نمک های تترازولیوم یک حلقه میانی با بار اضافه تحمیل شده حاصل از پیوند دوگانه بر روی یک گروه آمین دارند که این پیوند با بار مثبت در حضور یون هایی مثل بروم، پایدار می شوند.

اما نک های تترازولیوم وقتی در مجاورت یک ترکیب احیاء کننده قرار می گیرند به سادگی پیوند اضافه را از دست داده و با گرفتن یک پروتون احیاء می شوند. این واکنش کاهش باعث تغییر رنگ نمک و رسوب آن می شود.

در نهایت نمک رسوب کرده تحت عنوان فورمازان شناخته می شود. در تست های سمیت سنجی مواد به روش نمک های تترازولیوم، از خاصیت کاهندگی مولکول های حامل انرژی در سلول برای بررسی زنده‌مانی استفاده می شود. به عبارتی هرچقدر سلول سطح انرژی بالاتری داشته باشد نمک بیشتری را کاهش داده و باعث رسوب آن و تشکیل بلور فورمازان می شود.

• آزمایشگاه ژنیران معتبرترین مرجع ارائه کننده تست های سمیت سنجی مواد به روش MTT می باشد.

تست MTT؛ مزایا و معایب (شاخص ترین تکنیک سمیت سنجی مواد)

ترکیب MTT یا دی متیل تیازول دی فنیل تترازولیوم بروماید، جزء معروفترین ترکیباتی است که در تست های سمیت سنجی مواد مورد استفاده قرار می گیرد. در تست MTT نماینده سطح انرژی سلولی NADH می باشد و MTT پس از ورود به داخل سلول توسط آنزیم های ردوکتاز میتوکندریایی و NADH سلولی کاهش پیدا کرده و تبدیل به بلور فورمازان می شود. بلور فورمازان در حلال ترکیب ام تی تی قابل انحلال نیست و باید از حلال های آلی همچون دی متیل سولفوکساید یا ایزوپروپانول برای حل کردن آن استفاده کرد.

پس از انحلال فورمازان، جذب نوری آن در 510 nm و 570 nm بررسی می شود. جذب بالا به معنای سلول زنده‌ی بیشتر است. تست سمیت سنجی مواد به روش MTT جزء تکنیک های بسیار رایج می باشد؛ چرا که انجام آن بسیار ساده بوده و در یک تست می توان تعداد زیادی دارو را در غلظت های مختلف ارزیابی کرد.

همچنین زمان انجام آن کم بوده و امکانات ساده‌ای لازم دارد. اما باید توجه کرد اگرچه این تست داده های زیادی را ارائه می دهد اما این داده ها قابل اعتماد نیستند و نیاز به تست های پایین دستی تأییدی دارند. چرا که تست سمیت سنجی مواد به روش MTT وابسته به NADH سلولی می باشد و علاوه بر سلول های زنده، سلول های آپوپتوتیک هم مقادیر کمی NADH سلولی دارند.

این امر موجب می شود داده های حاصل شده خیلی قابل اعتماد نباشند. از طرفی در بررسی زنده مانی سلول به روش MTT دست آزمونگر بسیار دخیل در نتایج می باشد. چرا که بخش زیادی از آن به شکل دستی انجام شده و وابسته به خطای دست می باشد. از دیگر ترکیبات خانواده نمک های تترازولیوم می توان به XTT، MTS و MTA اشاره کرد.

اما با تمام این مسائل انجام تکنیک MTT یک کار اجتناب ناپذیر است و داده های اولیه آن برای انجام ادامه آزمایش ها مورد نیاز می باشد.

تست های زنده مانی و سمیت سنجی مواد بر پایه حفظ تمامیت غشاء و ساختار DNA

تکنیک های سمیت سنجی مواد بر روی سلول ها با استفاده از اختلاف های متابولیکی، جزء اصلی روش های مطالعه زنده مانی سلول ها می باشد و همانطور که گفته شد این روش ها اجتناب ناپذیر هستند اما باید توجه داشت که همیشه استفاده از نمک های تترازولیوم پاسخگو نخواهد بود. در صورتی که دارو یا موادی که برای تست مورد استفاده قرار می گیرند، خود به تنهایی، خاصیت احیاء کنندگی داشته باشند موجب به وجود آمدن خطا های زیادی در تست می شوند.

لذا محققان روش های جایگزینی را نیز برای بررسی کشندگی یا افزایش رشد سلولی ارائه داده‌اند. عموماً روش های دیگر مبتنی بر سایر تفاوت های سلولی در شرایط زنده بودن و مرده بودن مانند حفظ تمامیت غشاء و ساختار DNA می باشند.

در این تکنیک ها از رنگ ها  و مارکر هایی استفاده می شود که زنده مانی را بر اساس نفوذ پذیری غشاء تشخیص می دهند. یا پس از تشخیص نفوذپذیری، با رنگ آمیزی DNA سالم یا شکسته شده، زنده و مرده بودن سلول ها را مشخص می کنند.

به نوعی می توان گفت این تست ها دقت بالاتری نسبت به روش های سمیت سنجی مواد مانند MTT، XTT، MTA و MTS دارند اما از طرفی هزینه بر هستند. لذا عموماً ایتدا با تست MTT غلظت مؤثر دارویی مشخص شده و سپس از این قبیل تست ها به عنوان روش های پایین دستی تأیید کننده استفاده می کنند.

زنده ماندن یا مردن؟ مسئله این است!

در تکنیک های سمیت سنجی مواد اگرچه به نظر می رسد هدف کشتن سلول های سرطانی است اما همیشه تست با این هدف تعریف نمی شود. در بسیاری از موارد دارو هایی ساخته می شوند که هیچ ارتباطی به سرطان ندارند و توسط تست های سمیت سنجی  مواد، بی اثر بودن آن ها در فرآیند های طبیعی بیولوژیک و زنده مانی سلولی مشخص می شود.

یا در بسیاری از موارد تست های سمیت سنجی مواد برای داربست های طبیعی، سنتزی و همچنین ترکیبات نوترکیب که به عنوان تحریک کننده رشد استفاده می شوند، اجرا می شود تا نشان دهنده نه تنها عدم کشندگی بلکه افزایش رشد سلولی باشد. لذا با توجه به هدف یک پژوهشگر ممکن است مردن سلول ها نشانگر نتیجه خوب و یا زنده مانی سلول ها و همچنین افزایش رشد آن ها نشانگر موفقیت باشد.

روش های سمیت سنجی برای جامدات

در اکثر موارد ترکیباتی که بر روی زنده مانی یک سلول با روش های سمیت سنجی مواد، مورد بررسی قرار می گیرد محلول در آب می باشد. این ترکیبات به سادگی بر روی سلول تیمار شده و نتایج آن ها مشخص می شود. اما برای ترکیباتی مانند داربست ها و ایمپلنت های بیولوژیک، نمی توان به سادگی تست ام تی تی گذاشت. چرا که این ساختار ها قابلیت انحلال ندارند.

در چنین مواردی تست سمیت سنجی مواد (MTT) به روش مستقیم و غیر مستقیم گذاشته می شود. در روش مستقیم داربست مستقیما بر روی سلول ها قرار می گیرد و پس از گذشت زمان مناسب زنده مانی سلول ها سنجیده می شود.

به این روش Direct MTT نیز می گویند. اما در روش غیر مستقیم داربست برای زمان های مشخص در مجاورت محلول های فیزیولوژیک مانند PBS یا محیط کشت برای زمان های مشخصی قرار گرفته و عصاره داربست در آن محلول رها می شود. در نهایت از آن محلول برای بررسی زنده مانی سلول ها و سمیت سنجی مواد می توان استفاده کرد.

• چگونه یک داربست طبیعی بسازیم و برای آن تست MTT انجام دهیم؟

روش های سمیت سنجی اشعه ها

علاوه بر جامدات، تست های سمیت سنجی مواد و زنده مانی برای سلول ها توسط امواج الکترومغناطیس و حالت چهارم ماده (پلاسما) گذاشته می شود. در این شرایط نیز داروی محلولی برای تیمار کردن وجود ندارد و ممکن است سلول ها برای زمان های مشخصی توسط یک لیزر یا جت پلاسما تیمار شوند.

نویسنده: دکتر مسعود سلطانی