رنگ آمیزی زیل-نلسون: اصول و روش با نتایج

فهرست مطالب نمایش

رنگ آمیزی زیل-نلسون چیست؟

تکنیک رنگ آمیزی زیل-نلسون یک تکنیک رنگ آمیزی افتراقی است که در ابتدا توسط Ziehl توسعه یافت و بعداً توسط Neelsen اصلاح شد و به همین دلیل رنگ آمیزی زیل-نلسون نام گرفت.

نیلسن از کربول-فوشین (Carbol-fuschin) مربوط به روش Ziehl با حرارت استفاده کرد و با اضافه کردن یک عامل رنگ‌زدا با استفاده از الکل اسیدی و یک ضد رنگ با استفاده از رنگ متیلن بلو (Methylene blue)، تکنیک Ziehl-Neelsen برای رنگ آمیزی را توسعه داد.
استفاده از الکل اسیدی در این تکنیک نام رنگ آمیزی اسید فست (Acid-Fast Stain) را برای آن به ارمغان آورد و استفاده از حرارت در این روش نام روش حرارتی رنگ آمیزی اسید فست را به آن داده است که نامی مترادف برای تکنیک رنگ آمیزی زیل-نلسون است.
این تکنیک بر روی میکروارگانیسم‌هایی استفاده می‌شود که به راحتی توسط رنگ‌های بازی مانند رنگ آمیزی منفی (Negative staining) یا رنگ آمیزی گرم (Gram staining)، رنگ آمیزی نمی‌شوند. یکی از پیچیده‌ترین میکروارگانیسم‌هایی که شدیدا نیاز به رنگ آمیزی با ترکیبات زیل-نلسون دارد، گونه‌های مایکوباکتریوم (Mycobacterium) است.
مایکوباکتریوم، اکتینومیست‌ها (Actinomycete)، نورکادیا (Norcadia)، ایزوسپورا (Isospora)، کریپتوسپوریدیوم (Cryptosporidium) و برخی قارچ‌ها دارای دیواره سلولی ضخیمی هستند که از کمپلکس‌های لیپوئیدی (Lipoidal) به نام اسید مایکولیک (mycolic acid) تشکیل شده است.
رنگ آمیزی اسید مایکولیک دشوار است و بنابراین رنگ‌های ساده مانند رنگ آمیزی گرم نمی‌توانند به دیواره سلولی ضخیم این ارگانیسم‌ها نفوذ کنند.
آن‌ها به برخوردهای سخت‌تری نیاز دارند تا امکان نفوذ رنگ برای شناسایی و بررسی فراهم شود. از این رو از زیل-نلسون یا روش حرارتی رنگ آمیزی اسید فست استفاده می‌شود.

اهداف رنگ آمیزی زیل-نلسون

برای افتراق بین باسیل‌های اسید فست و باسیل‌های غیر اسید فست.
برای رنگ‎آمیزی گونه‌های مایکوباکتریوم.

اصول رنگ آمیزی زیل-نلسون

در رنگ آمیزی زیل-نلسون از ترکیبات بازی فوشین و فنل (phenol) برای رنگ آمیزی دیواره سلولی گونه‌های مایکوباکتریوم استفاده می‌شود.
مایکوباکتریوم به راحتی به رنگ‌های ساده نمی‌چسبد و بنابراین استفاده از حرارت همراه با کربول فوشین و فنل اجازه نفوذ به دیواره سلولی باکتری را برای تصویرسازی می‌دهد.
دیواره سلولی مایکوباکتریوم حاوی محتوای چربی بالایی است که از اسید مایکولیک روی دیواره سلولی آن تشکیل شده است و آن را مومی، آبگریز و نفوذناپذیر می‌کند. این چربی‌ها اسیدهای β-هیدروکسی‌کربوکسیلیک (ß-hydroxycarboxylic acid) هستند که از 90 اتم کربن تشکیل شده اند و مقاومت اسیدی باکتری‌ها را مشخص می‌کنند.
استفاده از کربول-فوشین که بازی است با قدرت به اجزای منفی باکتری که شامل اسید مایکولیک و دیواره سلولی لیپیدی می‌شود می‌چسبد. افزودن الکل اسیدی همراه با اعمال حرارت یک کمپلکس قوی را تشکیل می‌دهد که به راحتی با حلال‌ها شسته نمی‌شود.
باسیل‌های اسید فست رنگ قرمز یعنی رنگ اولیه کربول فوشین را می‌گیرند.
در حالی که باکتری‌های غیر اسید فست به راحتی با افزودن الکل اسیدی بی‌رنگ شده و رنگ متیلن بلو را می‌گیرند و آبی به نظر می‌رسند.
این تکنیک در شناسایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (Mycobacterium tuberculosis) و مایکوباکتریوم لپره (Mycobacterium leprae) استفاده می‌شود.

شناساگرهای مورد استفاده در رنگ آمیزی زیل-نلسون

کربول فوشین (رنگ اولیه)
اسید سولفوریک 20% یا الکل اسیدی (رنگ زدا)
رنگ متیلن بلو (ضد رنگ) یا مالاشیت گرین (Malachite green)

آماده‌سازی شناساگر

کربول فوشین

آب مقطر: 100 میلی‌لیتر
فوشین بازی: 1 گرم
اتیل الکل (اتانول 100٪): 10 میلی‌لیتر
کریستال‌های فنل: 5 میلی‌لیتر

الکل اسیدی (اسید هیدروکلریک 3 درصد در اتیل الکل 95 درصد)

اتیل الکل: 95 میلی‌لیتر
آب مقطر: 2 میلی‌لیتر
اسید هیدروکلریک غلیظ: 3 میلی‌لیتر

متیلن بلو 0.25٪ در اسید استیک 1٪

متیلن بلو: 0.25 گرم
آب مقطر: 99 میلی‌لیتر
اسید استیک: 1 میلی‌لیتر

روش رنگ آمیزی زیل-نلسون

روی یک لام میکروسکوپی استریل تمیز، اسمیر کشت نمونه را تهیه و اسمیر را حرارت دهید.
کاربول فوشین را روی اسمیر بریزید و به آرامی حرارت دهید تا بخار ایجاد کند.
اجازه دهید به مدت 5 دقیقه بماند، سپس آن را با جریان ملایم آب شیر بشویید.
اسید سولفوریک 20٪ را اضافه کرده و بگذارید 1 تا 2 دقیقه بماند. این مرحله را تا زمانی که در اسمیر رنگ صورتی ظاهر شود، تکرار کنید.
اسید را با آب بشویید.
اسمیر را به رنگ متیلن بلو آغشته کنید و بگذارید 2 تا 3 دقیقه بماند، سپس با آب بشویید.
اسمیر را با هوا خشک کنید و رنگ را زیر لنز روغن ایمرسیون (Oil immersion) بررسی کنید.