تکنیک SMRT

 SMRT

توالی یابی به روش SMRT یا single molecule real time یک روش توالی یابی DNA تک مولکولی موازی است. در این تکنیک از چیپ‌هایی استفاده می‌شود که دارای یک فیلم فلزی بسیار باریک می‌باشند. این فیلم فلزی حاوی هزاران حفره بوده که به آن‌ها ZMW یا Zero-Mode Waveguide گفته می‌شود. همچنین در بستر هر چاهک‌، یک آنزیم DNA پلیمراز مستقر شده و فرآیند پلیمریزاسیون شکل می‌گیرد.

ZMW ساختاری است که یک بخش قابل مشاهده روشنی را ایجاد می‌کند. این ناحیه به اندازه‌ای کوچک است که تنها یک نوکلئوتید منفرد از DNA را که توسط DNA پلیمراز ادغام شده، آشکار می‌سازد.

هر یک از چهار باز نوکلئوتیدی DNA به یکی از چهار رنگ مختلف فلورسنت متصل می‌گردد. هنگامی که یک نوکلئوتید توسط DNA پلیمراز ترکیب می‌شود، برچسب فلورسنت جدا و به خارج از ناحیه مشاهده ZMW انتشار می‌یابد یعنی جایی که فلورسانس آن دیگر قابل مشاهده نیست. یک detector، سیگنال فلورسنت ترکیب نوکلئوتید را تشخیص داده و شناسایی آن باز با توجه به فلورسانس مربوط به رنگش انجام می‌پذیرد.

تکنولوژی

همانطورکه ذکر گردید توالی یابی DNA روی چیپ‌هایی انجام می‌گیرد که حاوی تعداد زیادی ZMW است. در داخل هر ZMW، یک DNA پلیمراز فعال با مولکول منفرد از الگوی DNA تک رشته‌ای در انتهای آن تثبیت شده که نور قادر است از طریق آن نفوذ و بخش تجسمی را ایجاد نماید و بدین طریق امکان نظارت بر فعالیت DNA پلیمراز در سطح یک مولکول فراهم می‌شود؛ در حقیقت با اتصال نوکلئوتید لیبل دار به محل فعال DNAپلیمراز، رنگ فلورسنت رصد خواهد شد.

طی سنتز DNA سیگنال از یک نوکلئوتید متصل به فسفو که توسط DNA پلیمراز ترکیب شده است، شناسایی شده که تعیین توالی DNA در همان زمان وقوع را امکان‌پذیر می‌سازد.

آماده‌سازی الگو

جهت آماده‌سازی این قسمت، قطعات DNA با استفاده از پیوندهای آداپتور سنجاق سری به شکل دایره‌ای قرار می‌گیرند.

نوکلئوتید فسفولینک شده

هر یک از بازهای نوکلئوتیدی دارای یک مولکول رنگی فلورسنت مخصوص به خود هستند که سبب می‌شود detector در حین انجام سنتز DNA، بازی را که توسط DNA پلیمراز ادغام شده‌است شناسایی کند.

مولکول رنگی فلورسنت به زنجیره فسفات نوکلئوتید متصل است. هنگامی که نوکلئوتید توسط DNA پلیمراز ترکیب می شود، رنگ فلورسنت با زنجیره فسفات به عنوان بخشی از فرآیند سنتز DNA طبیعی که در طی آن یک پیوند فسفودی استر برای طویل شدن زنجیره DNA ایجاد گشته، جدا می‌شود. سپس مولکول رنگی فلورسنت شکافته و گسترش یافته تا آنجاکه دیگر سیگنال فلورسنت تشخیص داده نمی‌شود.

ZMW

ZMW یک ساختار محصور شده نانوفوتونیکی است که از منفذ دایره‌ای شکل در یک فیلم روکش آلومینیومی تشکیل شده و بر روی یک بستر سیلیسی شفاف قرار گرفته‌است. چاهک‌های ZWM، ۷۰ نانومتر قطر و ۱۰۰ نانومتر عمق دارند. به دلیل رفتار نور هنگام عبور از یک دیافراگم کوچک، میدان نوری به صورت تصاعدی در داخل محفظه تحلیل می‌رود. ناحیه قابل مشاهده در یک ZMW روشن ۲۰ زپتولیتر (^۲۱-۱۰×۲۰ لیتر) است. در این بخش، فعالیت DNA پلیمراز حاوی یک نوکلئوتید به آسانی قابل تشخیص می‌گردد.

عملکرد توالی

عملکرد توالی را می‌توان در طول خوانش، دقت عملیاتی کل در هر آزمایش اندازه گیری نمود. سیستم های توالی یابی PacBio با استفاده از ZMW مزیت خوانش طولانی را دارند، اگرچه نرخ خطا در حد ۱۵-۵٪ است و توان نمونه کمتر از پلتفرم‌های توالی یابی Illumina است. مزیتی که SMRT نسبت به سایر روش‌های توالی یابی دارد این است که تکنیک SMRT قادر به تعیین توالی قطعات بسیار طولانی بیش از ده کیلو باز هستند.

تاریخچه

Pacific Biosciences (PacBio) توالی یابی SMRT را در سال ۲۰۱۱،  پس از انتشار نسخه بتا ابزار RS خود در اواخر سال 2010 تجاری کرد.

RS  و  RS II

در روند تجاری، طول خوانش دارای توزیع نرمال با میانگین حدود ۱۱۰۰ باز بود. کیت شیمی جدیدی که در اوایل سال ۲۰۱۲ منتشر شد، طول خوانش توالی‌سنج را افزایش داد به طوری که یکی از مشتریان اولیه شیمی، میانگین طول خوانش را ۲۵۰۰ تا ۲۹۰۰ باز ذکر کرده بود اما کیت شیمی XL که در اواخر سال ۲۰۱۲ منتشر شد، میانگین طول خوانش را به بیش از ۴۳۰۰ باز افزایش داد.

در ۲۱ آگوست ۲۰۱۳، PacBio کیت اتصال DNA پلیمراز جدید P4 را منتشر نمود. این آنزیم P4 دارای میانگین طول خوانش بیش از ۴۳۰۰ باز در هنگام جفت شدن با توالی C2 و بیش از 5000 باز در صورت جفت شدن با XL است. دقت آنزیم مشابه C2 است و به QV50 بین 30X و 40X می‌رسد. P4، مجموعه‌های با کیفیت بالاتری را با استفاده از تعداد کمتر سلول‌های SMRT و فراخوانی بهبود یافته تری ارائه می‌دهند.

هنگامی که با  DNA ورودی (با استفاده از ابزار الکتروفورز مانند BluePippin) جفت گردد، میانگین طول خواندن بیش از ۷ کیلو باز می‌شود. در ۳ اکتبر ۲۰۱۳، PacBio ترکیب معرف جدیدی را برای PacBio RS II، DNA پلیمراز P5 با شیمی C3 (P5-C3) منتشر کرد. آن‌ها با یکدیگر، طول خواندن توالی را به طور متوسط ​​به ۸۵۰۰ باز رسانیده که طولانی ترین توالی خوانش‌ها به بیش از ۳۰۰۰۰ باز می‌رسد. نتایج نشان داده که به ازای هر سلول SMRT، حدود ۵۰۰ میلیون باز با به کارگیری توالی ‌یابی از رده سلول CHM1 وجود دارد.

در ۱۵ اکتبر ۲۰۱۴، PacBio انتشار جدید P6-C4 برای سیستم RS II را اعلام کرد که نشان دهنده نسل ششم پلیمراز است، و میانگین طول خوانش را به ۱۰۰۰۰ تا ۱۵۰۰۰ باز و حداکثر طول، بیش از ۴۰۰۰۰ باز معرفی نمود. انتظار می رفت توان عملیاتی جدید بین ۵۰۰ میلیون تا ۱ میلیارد باز در هر سلول SMRT بسته به نمونه‌ای که توالی یابی می‌شود باشد.

نمونه اولیه سلول SMRT حاوی حدود ۳۰۰۰ چاهک ZMW بود که امکان تعیین توالی DNA را فراهم می‌کرد. در مرحله تجاری‌سازی، سلول‌های SMRT هر کدام با ۱۵۰۰۰۰ چاهک ZMW طرح ریزی شده‌ بودند که در دو مجموعه ۷۵۰۰۰ ای خوانده می‌شد. در آوریل ۲۰۱۳، این شرکت نسخه جدیدی از توالی‌سنج را به نام “PacBio RS II” منتشر کرد که از تمام ۱۵۰۰۰۰ چاهک ZMW به طور همزمان استفاده نموده و توان عملیاتی را در هر آزمایش به دو برابر افزایش می‌دهد.

حداکثر توان عملیاتی در نوامبر ۲۰۱۳ با استفاده از اتصال P5، C3، انتخاب اندازه BluePippin و PacBio RS II رسماً ۳۵۰ میلیون باز در هر سلول SMRT به دست آورد، اگرچه مجموعه داده‌های انسانی de novo با میانگین شیمی ۵۰۰ میلیون باز در هر سلول SMRT منتشر شد. توان عملیاتی بر اساس نوع نمونه‌ای که توالی یابی می‌شود متفاوت است. با معرفی P6-C4، توان عملیاتی معمول در هر سلول SMRT به ۵۰۰ میلیون بایت تا ۱ میلیارد باز افزایش یافت.

عملکرد RS

کاربرد

توالی یابی SMRT ممکن است برای طیف وسیعی از تحقیقات ژنومیک مورد استفاده قرار گیرد. برای توالی‌یابی ژنومی جدید، طول‌های خوانده شده از توالی‌یابی SMRT در یک زمان با روش توالی‌یابی سنگر بر اساس خاتمه زنجیره دی‌اکسی نوکلئوتید قابل مقایسه یا حتی بیشتر است. طول خوانش بیشتر اجازه می‌دهد تا توالی ژنومی de novo و مجموعه ژنومی آسان‌تر باشد.

دانشمندان همچنین از این تکنیک توالی‌یابی در مجموعه‌های هیبریدی برای ژنوم‌های de novo استفاده می‌کنند تا داده‌های توالی خوانده‌شده کوتاه را با داده‌های توالی خوانده‌شده طولانی ترکیب نمایند. در سال ۲۰۱۲، چندین نشریه منتشر شد که تکمیل خودکار ژنوم باکتری‌ها را نشان می‌داد. در سال ۲۰۱۳، دانشمندان تخمین زدند که توالی یابی طولانی مدت می‌تواند برای جمع آوری و تکمیل بیشتر ژنوم‌های باکتریایی و آرکی‌ها استفاده گردد.

همچنین دانشمندان توسط SMRT قادر به تشخیص متیلاسیون و سایر مودیفیکیشن‌های باز هستند. در سال ۲۰۱۲ تیمی از دانشمندان از توالی یابی SMRT برای تولید متیلوم کامل شش باکتری استفاده کردند. در نوامبر ۲۰۱۲، دانشمندان گزارشی را در مورد متیلاسیون ژنومی شیوع یک سویه E. coli منتشر نمودند.

این تکنیک خوانش طولانی توالی ایزوفرم‌های کامل ژن، از جمله انتهای ۳ و ۵ را ممکن می سازد. این نوع توالی برای گرفتن ایزوفرم‌ها و انواع اسپلایس مفید است.

توالی یابی SMRT کاربردهای متعددی در تحقیقات ژنتیک پزشکی باروری در هنگام بررسی خانواده‌های مشکوک به موزاییک گناد والدین دارد. خوانش‌های طولانی، فازبندی هاپلوتیپ را در بیماران به منظور بررسی منشأ جهش‌ها ممکن می‌سازد. تعیین توالی عمیق، امکان تعیین و تخمین فراوانی آلل در سلول‌های اسپرم را امکان پذیر نموده که با خطر عود برای فرزندان مبتلا در آینده ارتباط دارد.

خلاصه

توالی یابی DNA روی چیپ‌هایی انجام می‌گیرد که حاوی تعداد زیادی ZMW است. در داخل هر ZMW، یک DNA پلیمراز فعال با مولکول منفرد از الگوی DNA تک رشته‌ای در انتهای آن تثبیت شده که نور قادر است از طریق آن نفوذ و بخش تجسمی را ایجاد نماید و بدین طریق امکان نظارت بر فعالیت DNA پلیمراز در سطح یک مولکول فراهم می‌شود در حقیقت با اتصال نوکلئوتید لیبل دار به محل فعال DNAپلیمراز، رنگ فلورسنت رصد خواهد شد.

طی سنتز DNA سیگنال از یک نوکلئوتید متصل به فسفو که توسط DNA پلیمراز ترکیب شده است، شناسایی شده که تعیین توالی DNA در همان زمان وقوع را امکان‌پذیر می‌سازد. این تکنیک دارای مزیت‌های بیشتری نسبت به سایر تکنیک‌هاست که می‌توان به توالی یابی قطعات طولانی، کاهش صرف وقت و زمان، مطالعه و بررسی تک مولکول‌ها اشاره نمود.

مترجم:نگارالسادات موسوی

مطالعه صدها مطلب علمی در حوزه بیولوژی

آرشیو جدیدترین خبرهای روز دنیای بیولوژی