تکنیک SDS-PAGE

 

 

تکنیک SDS-PAGE

SDS-PAGE (سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید الکتروفورز ژل) یک سیستم الکتروفورتیک ناپیوسته است که توسط Ulrich K. Laemmli توسعه یافته است که معمولاً به عنوان روشی برای جداسازی پروتئین‌هایی با جرم مولکولی بین 5 تا 250 کیلو دالتون استفاده می‌شود. استفاده ترکیبی از سدیم دودسیل سولفات SDS (که به عنوان سدیم لوریل سولفات نیز شناخته می شود) و ژل پلی آکریل آمید اجازه می‌دهد تا تأثیر ساختار و بار از بین رفته و پروتئین‌ها صرفاً بر اساس تفاوت در وزن مولکولی‌شان جدا شوند.

ویژگی‌های تکنیک SDS-PAGE

SDS-PAGE یک روش الکتروفورز است که امکان جداسازی پروتئین بر اساس جرم را فراهم می‌کند. محیط (محیط همچنین “ماتریکس” نامیده می‌شود) یک ژل ناپیوسته مبتنی بر پلی آکریل آمید است. ژل پلی آکریل آمید معمولاً بین دو صفحه شیشه ای در یک ژل دال قرار می‌گیرد. اگرچه ژل‌های لوله (در استوانه‌های شیشه‌ای) در طول تاریخ مورد استفاده قرار می‌گرفتند، اما با اختراع ژل‌های اسلب به سرعت منسوخ شدند. علاوه بر این، از SDS (سدیم دودسیل سولفات) در این مورد استفاده می‌شود.

حدود 1.4 گرم SDS به یک گرم پروتئین متصل می‌شود که مربوط به یک مولکول SDS در هر دو اسید آمینه است. SDS به‌عنوان یک سورفکتانت عمل می‌کند، بار ذاتی پروتئین‌ها را می‌پوشاند و نسبت‌های بار به جرم بسیار مشابهی را به آن‌ها می‌دهد. بارهای ذاتی پروتئین‌ها در مقایسه با بارگذاری SDS ناچیز است و بارهای مثبت نیز در محدوده pH پایه یک ژل جداکننده بسیار کاهش می‌یابد. با اعمال میدان الکتریکی ثابت، پروتئین به سمت آند حرکت می‌کند که هر کدام بسته به جرم آن سرعت متفاوتی دارند. این روش ساده امکان جداسازی دقیق پروتئین بر اساس جرم را فراهم می‌کند.

SDS تمایل به تشکیل میسل‌های کروی در محلول‌های آبی بالاتر از یک غلظت معین به نام غلظت بحرانی میسلی (CMC) دارد. بالاتر از غلظت بحرانی میسلی 7 تا 10 میلی مولار در محلول‌ها، SDS  به طور همزمان به صورت مولکول های منفرد (مونومر) و به صورت میسل، در زیر SDS فقط به صورت مونومر در محلول‌های آبی تشکیل می‌شود. در غلظت بحرانی میسلی، یک میسل از حدود 62 مولکول SDS تشکیل شده است. با این حال، تنها مونومرهای  SDS از طریق فعل و انفعالات آبگریز به پروتئین‌ها متصل می‌شوند، در حالی که میسل‌های SDS در خارج از ژل آنیونی هستند و هیچ پروتئینی را جذب نمی‌کنند.

SDS در طبیعی آمفی پاتیک است، که به وسیله این ویژگی می‌تواند بخش‌های قطبی و غیرقطبی ساختار پروتئین را باز کند. در غلظت‌های SDS بالای 0.1 میلی‌مولار، باز شدن پروتئین‌ها آغاز می‌شود و بالاتر از 1 میلی‌مولار، بیشتر پروتئین‌ها دناتوره می‌شوند. به دلیل اثر دناتوره کنندگی قوی SDS، تفکیک کمپلکس‌های پروتئینی و ساختارهای چهارتایی را نمی‌توان به طور کلی با SDS تعیین کرد. استثناها پروتئین‌هایی هستند که با اتصال متقابل کووالانسی تثبیت می‌شوند، به عنوان مثال، پیوندهای -S-S- و کمپلکس‌های پروتئینی مقاوم به SDS، که حتی در حضور SDS  پایدار هستند (اما دومی فقط در دمای اتاق).

برای دناتوره کردن کمپلکس‌های مقاوم به SDS، انرژی فعال‌سازی بالای مورد نیاز با گرم کردن به دست می‌آید. مقاومت SDS بر اساس فرا پایداری چین پروتئین است. اگرچه پروتئین بومی، کاملاً چین خورده و مقاوم به SDS در حضور SDS از ثبات کافی برخوردار نیست، ولی تعادل شیمیایی دناتوره شدن در دمای اتاق به کندی رخ می‌دهد. کمپلکس‌های پروتئین پایدار نه تنها با مقاومت SDS بلکه با پایداری در برابر پروتئازها و افزایش نیمه عمر بیولوژیکی مشخص می‌شوند.

روش دیگر، الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید را می‌توان با سورفکتانت‌های کاتیونی CTAB در CTAB-PAGE یا 16-BAC در BAC-PAGE انجام داد.

روش

روش SDS-PAGE از تهیه ژل، آماده سازی نمونه، الکتروفورز، رنگ آمیزی پروتئین یا وسترن بلات و تجزیه و تحلیل الگوی باندینگ تشکیل شده است.

• تولید ژل

هنگام استفاده از بافرهای مختلف در ژل (الکتروفورز ژل ناپیوسته)، ژل‌ها تا یک روز قبل از الکتروفورز ساخته می‌شوند، به طوری که انتشار منجر به مخلوط شدن بافرها نمی‌شود. ژل با پلیمریزاسیون رادیکال در قالبی متشکل از دو صفحه شیشه‌ای مهر و موم شده با فاصله بین صفحات شیشه ای تولید می‌شود. در یک تنظیم معمولی مینی ژل، اسپیسرها دارای ضخامت 0.75 میلی متر یا 1.5 میلی متر هستند که ظرفیت بارگیری ژل را تعیین می‌کند. برای ریختن محلول ژل، صفحات معمولاً در یک پایه بسته می‌شوند که به طور موقت سطح باز شده زیر صفحات شیشه ای را با دو اسپیسر مهر و موم می‌کند.

برای محلول ژل، آکریل آمید به عنوان ژل ساز(معمولا 4-7.7٪ در ژل انباشته و 10-12٪ در ژل جداکننده)، متیلن بیساکریل آمید به عنوان یک بافر ژل انباشته یا جداکننده، آب و SDS مخلوط می‌شود. با افزودن کاتالیزور TEMEDو آغازگر رادیکال آمونیوم پرسولفات (APS) پلیمریزاسیون آغاز می‌شود. سپس محلول بدون ایجاد حباب بین صفحات شیشه‌ای ریخته می‌شود.

بسته به مقدار کاتالیزور و استارتر رادیکال و بسته به دما، پلیمریزاسیون بین یک ربع ساعت تا چند ساعت طول می‌کشد. ژل پایینی (ژل جداکننده) ابتدا ریخته می‌شود و با چند قطره الکل (معمولاً بوتانول یا ایزوپروپانول اشباع از بافر) پوشانده می‌شود که حباب‌های منیسک را از بین می‌برد و از محلول ژل اکسیژن پاک کننده رادیکال محافظت می‌کند. پس از پلیمریزاسیون ژل جداکننده، الکل دور ریخته می‌شود و الکل باقی مانده با کاغذ صافی خارج می‌شود.

پس از افزودن APS و TEMED به محلول ژل انباشته، روی ژل جداسازی جامد ریخته می‌شود. سپس یک شانه نمونه مناسب بدون ایجاد حباب بین صفحات شیشه‌ای قرار می‌گیرد. شانه نمونه پس از پلیمریزاسیون با دقت بیرون کشیده می‌شود و چاهک‌هایی برای نمونه باقی می‌ماند. برای استفاده بعدی از پروتئین‌ها برای تعیین توالی پروتئین، ژل‌ها اغلب یک روز قبل از الکتروفورز تهیه می‌شوند تا واکنش‌های آکریل آمید پلیمر نشده با سیستئین‌ها در پروتئین‌ها کاهش یابد.

با استفاده از میکسر گرادیان، می توان ژل‌های گرادیان با گرادیان آکریل آمید (معمولاً از 4 تا 12 درصد) ریخته‌گری کرد که محدوده جدایی بیشتری از توده‌های مولکولی دارند. سیستم‌های ژل تجاری (به اصطلاح ژل‌های پیش ریخته‌گری) معمولاً از ماده بافر بیس تریس متان با مقدار pH بین 6.4 تا 7.2 هم در ژل انباشته و هم در ژل جداکننده استفاده می‌کنند. این ژل‌ها به صورت ریخته‌گری و آماده استفاده تحویل داده می‌شوند.

از آنجایی که آن‌ها فقط از یک بافر (الکتروفورز ژل مداوم) استفاده می‌کنند و pH تقریباً خنثی دارند، می‌توان آن‌ها را برای چند هفته ذخیره کرد. pH خنثی‌تر، هیدرولیز و در نتیجه تجزیه پلی آکریل آمید را کند می‌کند. علاوه بر این، سیستئین‌های اصلاح شده با آکریل آمید کمتری در پروتئین‌ها وجود دارد. به دلیل ثابت بودن pH در جمع آوری و جداسازی ژل، اثر انباشتگی ندارد. پروتئین‌های موجود در ژل BisTris  را نمی‌توان با کمپلکس های روتنیم رنگ آمیزی کرد. این سیستم ژل دارای محدوده جداسازی نسبتاً بزرگی است که می‌توان با استفاده از MES یا MOPS در بافر در حال اجرا آن را تغییر داد.

• آماده سازی نمونه

در طول آماده‌سازی نمونه، بافر نمونه و در نتیجه SDS، به میزان زیادی به پروتئین‌ها اضافه می‌شود و سپس نمونه به مدت پنج دقیقه تا دمای 95 درجه سانتی‌گراد یا 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی‌گراد گرم می‌شود. گرما با برهم زدن پیوندهای هیدروژنی و کشش مولکول‌ها، ساختارهای ثانویه و سوم پروتئین را مختل می‌کند. پس از خنک شدن تا دمای اتاق، هر نمونه به داخل چاه خود در ژل که قبلاً در بافر الکتروفورز در دستگاه الکتروفورز غوطه ور شده بود، پیپت می‌شود.

علاوه بر نمونه‌ها، معمولاً یک نشانگر اندازه وزن مولکولی روی ژل بارگذاری می‌شود. این شامل پروتئین‌هایی با اندازه‌های شناخته شده است و در نتیجه امکان تخمین (با خطای 10±٪) اندازه پروتئین‌ها در نمونه‌های واقعی را فراهم می‌کند که به طور موازی در مسیرهای مختلف ژل مهاجرت می‌کنند. نشانگر اندازه اغلب در اولین یا آخرین جیب ژل پیپت می‌شود.

• الکتروفورز

برای جداسازی، نمونه‌های دناتوره شده روی ژل پلی آکریل آمید قرار می‌گیرند که در بافر الکتروفورز با الکترولیت‌های مناسب قرار می‌گیرد. پس از آن، یک ولتاژ (معمولاً حدود 100 ولت، 10-20 ولت در هر سانتی متر طول ژل) اعمال می‌شود که باعث مهاجرت مولکول‌های دارای بار منفی از طریق ژل در جهت آند با بار مثبت می‌شود.

ژل مانند یک غربال عمل می‌کند. پروتئین‌های کوچک نسبتاً آسان از طریق مش ژل مهاجرت می‌کنند، در حالی که پروتئین‌های بزرگ‌تر احتمال بیشتری دارد که حفظ شوند و در نتیجه آهسته‌تر از طریق ژل مهاجرت می‌کنند و در نتیجه به پروتئین‌ها اجازه می‌دهند تا بر اساس اندازه مولکولی از هم جدا شوند. الکتروفورز بسته به ولتاژ و طول ژل مورد استفاده بین نیم ساعت تا چند ساعت طول می‌کشد.

پروتئین‌هایی که مهاجرت سریعی دارند (با وزن مولکولی کمتر از 5 کیلو دالتون) همراه با اجزای آنیونی بافر الکتروفورز، که از طریق ژل نیز مهاجرت می‌کنند، جلوی بافر را تشکیل می‌دهند. ناحیه جلوی بافر با افزودن رنگ نسبتاً کوچک آنیونی برمو فنول بلو به بافر نمونه قابل مشاهده است. به دلیل اندازه مولکول نسبتا کوچک برمو فنول بلو، سریع‌تر از پروتئین‌ها مهاجرت می‌کند. با کنترل نوری نوار رنگی مهاجرت می‌توان الکتروفورز را قبل از رنگ متوقف کرد و همچنین نمونه‌ها به طور کامل از ژل عبور کرده و آن را ترک کردند.

متداول ترین روش استفاده شده SDS-PAGE ناپیوسته است. در این روش، پروتئین‌ها ابتدا به یک ژل جمع کننده با pH خنثی مهاجرت می‌کنند که در آن متمرکز می‌شوند و سپس به یک ژل جداکننده با pH پایه مهاجرت می‌کنند که در آن جداسازی واقعی انجام می‌شود. ژل‌های انباشته و جداکننده با اندازه منافذ مختلف (4-6% T و 10-20% T)، قدرت یونی و مقادیر pH (pH 6.8 یا pH 8.8) متفاوت هستند. الکترولیت که بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرد، یک سیستم بافر تریس گلیسین-کلرید حاوی SDS است. در pH خنثی، گلیسین عمدتاً فرم زویتریونی را تشکیل می‌دهد، در PH بالا گلایسین‌ها بارهای مثبت را از دست می‌دهند و عمدتاً آنیونی می‌شوند.

در ژل جمع‌آوری، یون‌های کلرید کوچک‌تر و با بار منفی از جلوی پروتئین‌ها (به عنوان یون‌های پیشرو) و یون‌های گلیسینات کمی بزرگ‌تر، با بار منفی و نیمه مثبت به پشت پروتئین‌ها (به‌عنوان یون‌های دنباله‌دار اولیه) مهاجرت می‌کنند، در حالی که در مقایسه با پروتئین‌ها ژل جداکننده پایه هر دو یون در جلوی پروتئین‌ها مهاجرت می‌کنند.

گرادیان pH بین بافرهای ژل انباشتگی و جداسازی منجر به اثر انباشتگی در مرز ژل انباشته به ژل جداسازی می‌شود، زیرا گلیسینات تا حدی بارهای مثبت آهسته‌ کننده خود را با افزایش pH از دست می‌دهد و سپس، به عنوان یون عقب‌ نشین سابق، پیشی می‌گیرد. پروتئین‌ها و تبدیل به یک یون پیشرو می‌شود که باعث می‌شود باندهای پروتئین‌های مختلف (پس از رنگ آمیزی قابل مشاهده) باریک‌تر و تیزتر شوند، مانند اثر انباشتگی. برای جداسازی پروتئین‌ها و پپتیدهای کوچک‌تر، از سیستم بافر TRIS-Tricine Schägger و von Jagow استفاده می‌شود که دلیل آن گسترش بیشتر پروتئین‌ها در محدوده 0.5 تا 50 کیلو دالتون است.

• رنگ آمیزی ژل

در پایان جداسازی الکتروفورتیک، همه پروتئین‌ها بر اساس اندازه مرتب می‌شوند و سپس می‌توان آن‌ها را با روش‌های دیگر تجزیه و تحلیل کرد. رنگ آمیزی پروتئین مانند رنگ آمیزی Coomassie (متداول ترین و آسان برای استفاده) ، رنگ آمیزی نقره (بالاترین حساسیت) ، رنگ آمیزی تمام رنگ‌ها، رنگ آمیدو سیاه 10B، رنگ آمیزی سبز سریع FCF، لکه‌های فلورسنت مانند رنگ epicocconone و رنگ نارنجی SYPRO، و تشخیص ایمونولوژیک مانند وسترن بلات.

رنگ‌های فلورسنت خطی نسبتاً بالاتری بین کمیت پروتئین و شدت رنگ در حدود سه مرتبه قدر بالاتر از حد تشخیص دارند. مقدار پروتئین را می‌توان با شدت رنگ تخمین زد. هنگام استفاده از رنگ پروتئین فلورسنت تری کلرو اتانول، رنگ آمیزی پروتئین بعدی حذف می‌شود اگر به محلول ژل اضافه شود و ژل با نور UV پس از الکتروفورز تابش شود.

در رنگ آمیزی کوماسی، ژل در محلول 50% اتانول 10% اسید استیک گلاسیال به مدت 1 ساعت ثابت می‌شود. سپس محلول را برای محلول تازه عوض کرده و پس از 1 تا 12 ساعت ژل به محلول رنگ‌ آمیزی (50% متانول، 10% اسید استیک گلاسیال، 0.1% کوماسی برلیانت آبی) و سپس رنگ‌ زدایی چندین بار محلول رنگ‌ آمیزی 40% تغییر می‌کند. متانول، 10٪ اسید استیک یخبندان.

• تحلیل و بررسی

رنگ آمیزی پروتئین در ژل یک الگوی نواری قابل اثبات از پروتئین‌های مختلف ایجاد می‌کند.

• گلیکوپروتئین‌ها دارای سطوح متفاوتی از گلیکوزیلاسیون هستند و SDS را به طور غیر یکنواختی در گلیکوزیلاسیون‌ها جذب می‌کنند و در نتیجه نوارهای گسترده تر و تار ایجاد می‌کنند.
• پروتئین‌های غشایی، به دلیل دامنه گذر غشایی خود، اغلب از اسیدهای آمینه آبگریزتر تشکیل شده‌اند، حلالیت کمتری در محلول‌های آبی دارند، تمایل به اتصال به لیپیدها دارند و به دلیل اثرات آبگریز تمایل به رسوب در محلول‌های آبی دارند (زمانی که مقادیر کافی مواد شوینده وجود ندارد). این رسوب خود را برای پروتئین‌های غشایی در یک SDS-PAGE در بالای نوار پروتئین گذرنده نشان می‌دهد. در این حالت می‌توان از SDS بیشتری استفاده کرد (با استفاده از بافر نمونه غلیظ بیشتر یا بیشتر) و میزان پروتئین در کاربرد نمونه را کاهش داد.
• بارگیری بیش از حد ژل با یک پروتئین محلول، نوار نیم دایره‌ای از این پروتئین را ایجاد می‌کند (مثلاً در خط نشانگر تصویر در 66 کیلو دالتون)، که به پروتئین‌های دیگر با وزن مولکولی مشابه اجازه می‌دهد تا پوشش داده شوند.
• کنتراست کم بین باندهای داخل یک خط، یا وجود پروتئین‌های زیاد (خلوص پایین) را نشان می‌دهد یا اگر از پروتئین‌های خالص ‌شده استفاده می‌شود و کنتراست پایین فقط در زیر یک باند تشکیل می‌شود، نشان ‌دهنده یک پروتئولیتیک است. تخریب پروتئین، که ابتدا باعث ایجاد نوارهای تخریب می‌شود و پس از تخریب بیشتر، لکه در زیر یک نوار ایجاد می‌کند.

مستندسازی الگوی باند معمولاً با عکاس برداری یا اسکن انجام می‌شود. برای بازیابی بعدی مولکول‌ها در نوارهای جداگانه، می‌توان استخراج ژل را انجام داد.

• آرشیو کردن

پس از رنگ آمیزی پروتئین و مستندسازی الگوی نواری، ژل پلی آکریل آمید را می‌توان برای ذخیره سازی بایگانی خشک کرد. ژل یا در یک قاب خشک کن (با یا بدون استفاده از گرما) یا در خشک کن خلاء قرار می‌گیرد. قاب خشک کن از دو قسمت تشکیل شده است که یکی از آنها به عنوان پایه‌ای برای یک فیلم سلفون مرطوب است که ژل و محلول گلیسرول یک درصد به آن اضافه می‌شود.

سپس یک فیلم سلفون مرطوب دوم بدون حباب اعمال می‌شود، قسمت دوم قاب روی آن قرار می‌گیرد و قاب با گیره‌ها مهر و موم می‌شود. حذف حباب‌های هوا از تکه تکه شدن ژل در طول خشک شدن جلوگیری می‌کند. آب از طریق فیلم سلفون تبخیر می‌شود. برخلاف قاب خشک کن، خشک کن خلاء، خلاء ایجاد می‌کند و ژل را تا حدود 50 درجه سانتی گراد گرم می‌کند.

تعیین جرم مولکولی

برای تعیین دقیق‌تر وزن مولکولی، فواصل مهاجرت نسبی تک تک باندهای پروتئینی در ژل جداکننده اندازه‌گیری می‌شود. اندازه‌گیری‌ها معمولاً در سه تکرار برای افزایش دقت انجام می‌شود. تحرک نسبی (مقدار Rf یا Rm نامیده می شود) ضریب فاصله باند پروتئین و فاصله جبهه بافر است.

فاصله باندها و جلوی بافر هر کدام از ابتدای ژل جداسازی اندازه‌گیری می‌شود. فاصله جلوی بافر تقریباً با فاصله برمو فنل آبی موجود در بافر نمونه مطابقت دارد. فواصل نسبی پروتئین‌های نشانگر اندازه به صورت نیمه لگاریتمی در برابر وزن مولکولی شناخته شده آن‌ها رسم می‌شود. با مقایسه با بخش خطی نمودار تولید شده یا با تجزیه و تحلیل رگرسیون، وزن مولکولی یک پروتئین ناشناخته را می‌توان با تحرک نسبی آن تعیین کرد.

نوارهای پروتئین با گلیکوزیلاسیون می‌توانند تار شوند. پروتئین‌های دارای بسیاری از اسیدهای آمینه اساسی (مانند هیستون‌ها) می‌توانند منجر به تخمین بیش از حد وزن مولکولی یا حتی عدم مهاجرت آن‌ها به ژل شوند، زیرا در الکتروفورز به دلیل بارهای مثبت یا حتی در جهت مخالف، کندتر حرکت می‌کنند. بر این اساس، بسیاری از اسیدهای آمینه اسیدی می‌توانند منجر به مهاجرت سریع یک پروتئین و دست کم گرفتن جرم مولکولی آن شوند.

کاربردهای تکنیک SDS-PAGE

SDS-PAGE در ترکیب با رنگ پروتئین به طور گسترده در بیوشیمی برای جداسازی سریع و دقیق و تجزیه و تحلیل بعدی پروتئین‌ها استفاده می‌شود. هزینه ابزار و معرف نسبتاً پایینی دارد و روشی آسان برای استفاده است. به دلیل مقیاس پذیری کم، بیشتر برای اهداف تحلیلی و کم‌تر برای اهداف آماده سازی استفاده می‌شود، به خصوص زمانی که مقادیر بیشتری از پروتئین جداسازی شود.

علاوه بر این، SDS-PAGE در ترکیب با وسترن بلات برای تعیین وجود یک پروتئین خاص در مخلوطی از پروتئین‌ها یا برای تجزیه و تحلیل تغییرات پس از ترجمه استفاده می‌شود. اصلاحات پس از ترجمه پروتئین‌ها می‌تواند منجر به تحرک نسبی متفاوت (یعنی تغییر باند) یا تغییر در اتصال آنتی بادی شناسایی مورد استفاده در وسترن بلات شود (یعنی یک نوار ناپدید یا ظاهر شود).

در طیف‌سنجی جرمی پروتئین‌ها، SDS-PAGE یک روش پر کاربرد برای آماده‌سازی نمونه قبل از طیف‌سنجی است که عمدتاً از هضم در ژل استفاده می‌کند. در مورد تعیین جرم مولکولی یک پروتئین، SDS-PAGE کمی دقیق‌تر از اولترا سانتریفیوژ تحلیلی است، اما دقت کمتری نسبت به طیف سنجی جرمی دارد.

در تشخیص پزشکی، SDS-PAGE به عنوان بخشی از آزمایش HIV و برای ارزیابی پروتئینوری استفاده می‌شود. در آزمایش HIV، پروتئین‌های HIV توسط SDS-PAGE جدا می‌شوند و در صورت وجود در سرم خون بیمار، توسط وسترن بلات با آنتی‌بادی‌های اختصاصی HIV شناسایی می‌شوند. SDS-PAGE برای پروتئینوری سطوح پروتئین های مختلف سرم را در ادرار ارزیابی می‌کند، به عنوان مثال، آلبومین، آلفا-2-ماکروگلوبولین و IgG.

انواع

SDS-PAGE پرکاربردترین روش برای جداسازی ژل الکتروفورتیک پروتئین‌ها است. الکتروفورز ژل دو بعدی به طور متوالی فوکوس ایزوالکتریک یا BAC-PAGE را با SDS-PAGE ترکیب می‌کند. اگر قرار است تا‌خوردگی پروتئین بومی حفظ شود، PAGE بومی استفاده می‌شود. برای جداسازی پروتئین‌های غشایی، BAC-PAGE یا CTAB-PAGE ممکن است به عنوان جایگزینی برای SDS-PAGE استفاده شود. برای جداسازی الکتروفورزی کمپلکس‌های پروتئینی بزرگ‌تر، می‌توان از الکتروفورز ژل آگارز استفاده کرد، به عنوان مثال، SDD-AGE برخی از آنزیم‌ها را می‌توان از طریق فعالیت آنزیمی توسط زیموگرافی تشخیص داد.

جایگزین‌های تکنیک SDS-PAGE

SDS-PAGE در حالی که یکی از دقیق‌تر و کم‌هزینه‌ترین روش‌های جداسازی و آنالیز پروتئین است، پروتئین‌ها را دناتوره می‌کند. در مواردی که شرایط غیر دناتوره‌ای ضروری است، پروتئین‌ها با یک PAGE بومی یا روش‌های کروماتوگرافی متفاوت با کمی‌سنجی فتومتریک بعدی جدا می‌شوند، برای مثال کروماتوگرافی میل ترکیبی (یا حتی خالص‌سازی میل ترکیبی پشت سر هم) و کروماتوگرافی تبادل یونی.

پروتئین‌ها همچنین می‌توانند بر اساس اندازه در فیلتراسیون جریان مماسی یا اولترافیلتراسیون جدا شوند. تک پروتئین‌ها را می‌توان با کروماتوگرافی میل ترکیبی یا با روش pull-down از یک مخلوط جدا کرد. برخی از روش‌های جداسازی اولیه و مقرون‌ به ‌صرفه، اما معمولاً مبتنی بر یک سری از استخراج‌ها و رسوب‌گذاری‌ها با استفاده از مولکول‌های kosmotropic هستند، به‌عنوان مثال، بارش سولفات آمونیوم و رسوب پلی‌ اتیلن گلیکول.

تاریخچه تکنیک SDS-PAGE

در سال 1948، Arne Tiselius  به دلیل کشف اصل الکتروفورز به عنوان مهاجرت اتم‌ها یا مولکول‌های باردار و محلول در یک میدان الکتریکی، جایزه نوبل شیمی را دریافت کرد. استفاده از یک ماتریس جامد (در ابتدا دیسک‌های کاغذی) در الکتروفورز ناحیه ای جداسازی را بهبود بخشید.

الکتروفورز ناپیوسته در سال 1964 توسط L. Ornstein و B. J. Davis امکان بهبود جداسازی توسط اثر انباشتگی را فراهم کرد. استفاده از هیدروژل‌های پلی آکریل آمید با پیوند متقابل، بر خلاف دیسک‌های کاغذی یا ژل‌های نشاسته‌ای که قبلا استفاده می‌شد، پایداری بالاتر ژل و عدم تجزیه میکروبی را فراهم کرد.

اثر دناتوره کنندگی SDS در ژل‌های پلی آکریل آمید پیوسته برای اولین بار در سال 1965 توسط David F. Summers در گروه کاری James E. Darnell برای جداسازی پروتئین‌های ویروس فلج اطفال توصیف شد. نوع فعلی SDS-PAGE در سال 1970 توسط Ulrich K. Laemmli بیان شد و در ابتدا برای مشخص کردن پروتئین های سر باکتریوفاژ T4 استفاده شد. این مقاله Laemmli به طور گسترده برای اختراع SDS-PAGE مدرن مورد استناد قرار گرفته است، اما این تکنیک در واقع توسط Jake Maizel ابداع شد. Maizel فناوری قبلی خود را با Laemmli به اشتراک گذاشت و آن‌ها با هم پیشرفت‌های بیشتری داشتند.

مترجم: امید آهنگریان ابهری

 

مطالعات بیشتر در بخش راهنمای علمی سایت

منبع