توالی‌یابی شاتگان: اصول، انواع، فرآیند و کاربردها

فهرست مطالب نمایش

توالی‌یابی شاتگان چیست؟

توالی‌یابی شاتگان روشی برای تعیین توالی DNA موجود زنده است که با شکستن تصادفی DNA به قطعات کوچک و سپس اتصال مجدد توالی‌ها با استفاده از نواحی همپوشانی انجام می‌شود. نام «شات‌گان» از فرآیند تکه‌تکه کردن تصادفی شبیه شلیک شات‌گان گرفته شده است.

ایده توالی‌یابی شاتگان برای اولین بار در سال ۱۹۷۹ توسط استادن (Staden) به منظور تسریع فرآیند توالی‌یابی پیشنهاد شد، زیرا این روش امکان توالی‌یابی ژنوم‌های بزرگتر را در مدت زمان کوتاه‌تری فراهم می‌کند. اولین پروتکل توالی‌یابی شاتگان توسط مسینگ (Messing) در سال ۱۹۸۱ با استفاده از ناقل فاژ M13 توسعه یافت.

یک سال بعد، در سال ۱۹۸۲، سنگر (Sanger) از روش شات‌گان برای توالی‌یابی ژنوم فاژ λ استفاده کرد. در سال ۱۹۹۵، ونتر (Venter) و اسمیت (Smith) روش توالی‌یابی کل ژنوم با شات‌گان (whole-genome shotgun sequencing) را برای توالی‌یابی ژنوم باکتری هموفیلوس آنفلوانزا (Haemophilus influenzae) توسعه دادند. ونتر از این روش در اواخر دهه ۱۹۹۰ برای توالی‌یابی ژنوم انسان استفاده کرد.

امروزه توالی‌یابی شاتگان اغلب با استفاده از پلتفرم‌های توالی‌یابی نسل جدید (NGS) انجام می‌شود. فناوری‌های NGS به دلیل مقرون به صرفه بودن و سرعت بالا به طور گسترده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرند. NGS می‌تواند حجم عظیمی از داده‌های تولید شده توسط توالی‌یابی شاتگان را مدیریت کند.

اصول توالی‌یابی شاتگان

توالی‌یابی شاتگان بر اساس اصل شکستن تصادفی DNA به قطعات کوچک و توالی‌یابی جداگانه آنها عمل می‌کند. اصل اصلی ایجاد تعداد زیادی از توالی‌های کوتاه DNA با تکه‌تکه کردن است که سپس توسط ابزارهای تخصصی بیوانفورماتیک برای شناسایی مناطق همپوشانی تجزیه و تحلیل می‌شوند. از این نواحی همپوشانی برای کنار هم قرار دادن خوانش‌ها (reads) و بازسازی کل ژنوم استفاده می‌شود.

توالی‌یابی شاتگان با استخراج و خالص سازی DNA از ارگانیسم مورد نظر آغاز می‌شود. سپس این DNA خالص شده به قطعات کوچک تصادفی تقسیم می‌شود. هر قطعه به صورت جداگانه با استفاده از فناوری‌های مختلف توالی‌یابی توالی‌یابی می‌شود که حجم عظیمی از خوانش‌های کوتاه DNA را تولید می‌کند. سپس از ابزارهای مختلف بیوانفورماتیک برای اسمبل (Assemble) همپوشانی بین این خوانش‌ها و تجزیه و تحلیل داده‌های توالی‌یابی برای بازسازی کل ژنوم استفاده می‌شود.

انواع توالی‌یابی شاتگان

دو روش اصلی برای توالی‌یابی شاتگان وجود دارد:

۱. توالی‌یابی شات‌گان سلسله مراتبی (Hierarchical Shotgun Sequencing)

توالی‌یابی شات‌گان سلسله مراتبی، که همچنین به عنوان توالی‌یابی کلون به کلون (clone-by-clone sequencing) شناخته می‌شود، شامل توالی‌یابی ژنوم‌های بزرگ با کلون کردن قطعات DNA در ناقل‌ها و سپس نقشه برداری از ژنوم قبل از توالی‌یابی است.

DNA استخراج شده با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده یا برش مکانیکی به قطعات تقسیم می‌شود و این قطعات در ناقل‌هایی مانند کروموزوم‌های مصنوعی باکتریایی (BAC) برای ایجاد یک کتابخانه کلونی وارد می‌شوند. گام بعدی ایجاد یک نقشه فیزیکی از ژنوم با استفاده از تکنیک‌هایی مانند نقشه برداری با آنزیم محدودکننده است.

سپس کلون‌های منفرد انتخاب شده و برای توالی‌یابی آماده می‌شوند. داده‌های توالی اسمبل و انوتیشن می‌شوند تا توالی کامل ژنوم بازسازی شود. توالی‌های اسمبل شده بررسی می‌شوند و در صورت لزوم، شکاف‌ها با استفاده از روش‌های توالی‌یابی اضافی پر می‌شوند.

مزیت اصلی این روش، توانایی کار با ژنوم‌های بزرگ است. همچنین، مرحله نقشه برداری اطلاعات مفیدی در مورد ساختار ژنوم‌ها ارائه می‌دهد. با این حال، این فرآیند می‌تواند زمان‌بر و پرهزینه باشد زیرا شامل ساخت نقشه فیزیکی و توالی‌یابی تک تک نواحی است.

پروژه ژنوم انسان با موفقیت از این روش برای توالی‌یابی ژنوم‌های انسانی استفاده کرد.

۲. توالی‌یابی شات‌گان کل ژنوم (Whole Genome Shotgun Sequencing)

توالی‌یابی شات‌گان کل ژنوم با شات‌گان کل ژنوم را مستقیماً بدون مرحله نقشه برداری اولیه توالی‌یابی می‌کند.

در این روش، DNA به طور تصادفی به قطعات کوچک شکسته شده و توالی‌یابی می‌شود. داده‌های توالی‌یابی با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیک اسمبل (Assemble) می‌شوند. این توالی‌های اسمبل شده انوتیشن و تحلیل می‌شوند تا توالی کامل ژنوم ایجاد شود.

این روش نسبت به توالی‌یابی سلسله مراتبی با شات‌گان سریع‌تر و به صرفه‌تر است زیرا نیازی به ساخت نقشه فیزیکی و توالی‌یابی تک تک نواحی ندارد.

با این حال، اسمبل (Assemble) قطعات توالی‌یابی شده در این روش می‌تواند دشوار باشد. همچنین نبود نقشه فیزیکی تجزیه و تحلیل داده‌ها را با مشکل مواجه می‌کند.

کریگ ونتر (Craig Venter) و همکارانش با موفقیت کل ژنوم انسان را با استفاده از این روش در Celera Genomics که برای توالی‌یابی سریع‌تر ژنوم انسان نسبت به پروژه ژنوم انسان تأسیس شد، توالی‌یابی و اسمبل (Assemble) کردند.

مقایسه توالی‌یابی سلسله مراتبی با شات‌گان و توالی‌یابی کل ژنوم با شات‌گان

ویژگی	توالی‌یابی سلسله مراتبی با شات‌گان	توالی‌یابی کل ژنوم با شات‌گان
روش	شامل توالی‌یابی کلون‌های منفرد به صورت مرتب	شامل توالی‌یابی قطعات تصادفی از ژنوم
نقشه فیزیکی	شامل ایجاد نقشه فیزیکی قبل از توالی‌یابی	نیازی به نقشه فیزیکی ندارد
زمان	به دلیل مراحل متعدد زمان‌برتر است	با حذف مرحله نقشه برداری فیزیکی سریع‌تر است
مناسب برای اندازه ژنوم	برای ژنوم‌های بزرگ و پیچیده مناسب‌تر است	برای ژنوم‌های کوچک کارآمدتر است
نیاز به محاسبات	از نظر محاسباتی پیچیدگی کمتری دارد و نیاز به منابع محاسباتی پایین‌تری دارد	از نظر محاسباتی پیچیده‌تر است و نیاز به منابع محاسباتی بالاتری دارد

فرآیند توالی‌یابی شاتگان

فرآیند توالی‌یابی شاتگان به هفت مرحله زیر تقسیم می‌شود:

۱. آماده‌سازی نمونه

در این مرحله اولیه، نمونه‌های محیطی یا بیولوژیکی مورد نظر جمع‌آوری و برای استخراج DNA پردازش می‌شوند. استخراج DNA با استفاده از روش‌های فیزیکی و شیمیایی مختلف انجام می‌شود. ابتدا سلول‌ها برای آزادسازی DNA لیز می‌شوند. سپس DNA از سایر اجزای سلولی جدا می‌شود.

۲. شکستن قطعات DNA

DNA استخراج‌شده مورد نظر سپس با استفاده از روش‌هایی مانند سونیکیشن به طور تصادفی به قطعات کوچک تقسیم می‌شود. برای اطمینان از نمایش بی‌طرفانه ژنوم، قطعات به صورت تصادفی ایجاد می‌شوند. این قطعات برای ایجاد انتهای صاف مناسب برای اتصال آداپتور، تحت ترمیم انتهایی قرار می‌گیرند.

۳. ساخت کتابخانه

این مرحله شامل آماده سازی قطعات DNA برای توالی‌یابی است. قطعات DNA با آداپتورهای لیگات‌شده برای ایجاد کتابخانه‌ای از قطعات آماده برای توالی‌یابی تکثیر می‌شوند. کتابخانه حاصل حاوی مجموعه‌ای از تمام قطعات DNA آماده شده است که روی پلتفرم توالی‌یابی بارگذاری می‌شود.

۴. توالی‌یابی

هر یک از قطعات به طور مستقل توالی‌یابی می‌شوند. چندین دور توالی‌یابی روی همان نمونه DNA انجام می‌شود تا خوانش‌های کوتاه متعددی ایجاد شود. توالی‌یابی شاتگان از فناوری‌های مختلف توالی‌یابی با توان عملیاتی بالا استفاده می‌کند که می‌تواند خوانش‌های کوتاه را از DNA تکه‌تکه‌شده تصادفی تولید کند. این امر به سرعت حجم عظیمی از داده‌های توالی را ایجاد می‌کند. داده‌های خام توالی با استفاده از فراخوان بازی (base calling) پردازش می‌شوند تا توالی نوکلئوتیدی تعیین شود.

۵. اسمبل (Assemble)

در این مرحله، از داده‌های توالی‌یابی و قطعات همپوشانی برای اسمبل (Assemble) خوانش‌های کوتاه DNA به توالی‌های پیوسته طولانی‌تر به نام کانتیگ (contig) استفاده می‌شود. کانتیگ‌ها برای بازسازی توالی کامل ژنوم بیشتر تراز و اسمبل (Assemble) می‌شوند. هرگونه شکافی بین کانتیگ‌ها با استفاده از تکنیک‌های توالی‌یابی اضافی یا ابزارهای بیوانفورماتیک پر می‌شود. کنترل کیفیت برای حذف خوانش‌های با کیفیت پایین و توالی‌های آداپتور قبل از اسمبل (Assemble) استفاده می‌شود. همچنین پس از اسمبل (Assemble) برای بررسی کیفیت کانتیگ‌ها و تصحیح خطاها انجام می‌شود.

۶. انوتیشن و آنالیز

سپس نمونه برای پیش‌بینی ساختار و عملکرد ژن‌ها انوتیشن می‌شود. این شامل انوتیشن ساختاری و عملکردی است. همچنین برای تعیین مناطق غیرکدکننده از جمله عناصر تنظیمی استفاده می‌شود. این مرحله برای تبدیل داده‌های خام توالی به اطلاعات معنی‌دار مفید است.

مزایای توالی‌یابی شاتگان

توالی‌یابی شاتگان نسبت به روش‌های سنتی، با کاهش زمان و منابع مرتبط با توالی‌یابی ژنوم، روشی به صرفه‌تر است. توالی‌یابی شاتگان را می‌توان روی نمونه‌های DNA با حجم بالا انجام داد و قادر است کل ژنوم‌ها را توالی‌یابی کند. توالی‌یابی شاتگان سریع است زیرا می‌تواند بسیاری از قطعات DNA را به طور همزمان توالی‌یابی کند و نیازی به مراحل زمان‌بر نقشه برداری قبل از توالی‌یابی ندارد. این روش می‌تواند همزمان میلیون‌ها قطعه را پردازش کند و در مدت زمان کوتاهی حجم عظیمی از داده را تولید کند.

محدودیت‌های توالی‌یابی شاتگان

توالی‌یابی شاتگان حجم عظیمی از داده تولید می‌کند که نیازمند منابع محاسباتی قابل توجه و ابزارهای بیوانفورماتیک برای اسمبل (Assemble) خوانش‌های توالی کوتاه به یک ژنوم کامل است. اسمبل (Assemble) ژنوم‌های پیچیده، به ویژه آنهایی که دارای توالی‌های تکراری هستند، می‌تواند چالش برانگیز باشد و منجر به خطا در توالی شود.

اسمبل (Assemble) نادرست قطعات به دلیل توالی‌های تکراری یا خطاهای توالی‌یابی می‌تواند منجر به بازسازی نادرست ژنوم شود. در مواردی که خطاهایی از توالی‌یابی شاتگان رخ می‌دهد، ممکن است نیاز به توالی‌یابی اضافی با استفاده از روش‌های پرکارتر باشد.

ممکن است مناطقی از ژنوم وجود داشته باشد که توسط هیچ قطعه توالی‌یابی شده‌ای پوشانده نشود و منجر به ایجاد شکاف در ژنوم اسمبل (Assemble) شده شود. مناطق با پیچیدگی کم ممکن است در توالی‌یابی شاتگان کم‌نمایش داده شوند یا به طور کامل از دست بروند.

کاربردهای توالی‌یابی شاتگان

توالی‌یابی شاتگان در مطالعات کل ژنوم استفاده می‌شود که نقش مهمی در درک تغییرات ژنتیکی و جهش‌های مرتبط با بیماری‌های نادر یا انواع مختلف سرطان دارد. توالی‌یابی شاتگان به طور گسترده در متاژنومیکس برای مطالعه ژنوم جوامع میکروبی موجود در نمونه‌های محیطی استفاده می‌شود.

توالی‌یابی شاتگان در تشخیص‌های بالینی برای شناسایی اختلالات ژنتیکی و عوامل بیماری‌زا به طور مستقیم از نمونه‌های بیماران کاربرد دارد. همچنین این روش به شناسایی مناطق غیرکدکننده ژنوم کمک می‌کند که برای درک عملکرد ژن و الگوهای بیان آن ضروری است.

توالی‌یابی شاتگان را می‌توان در علم پزشکی قانونی برای تجزیه و تحلیل نمونه‌های DNA پزشکی قانونی به کار برد. توالی‌یابی شاتگان همچنین می‌تواند برای بهبود دقت توالی‌های مرجع ژنوم موجود با حذف خطاها، پر کردن شکاف‌ها و تصحیح اشتباهات مورد استفاده قرار گیرد.

همچنین بخوانید: