توالی‌یابی آکسفورد نانوپور: اصل، پروتکل، کاربردها

توالی‌یابی آکسفورد نانوپور چیست؟

توالی‌یابی آکسفورد نانوپور یک روش توالی‌یابی نانوپور است که توسط Oxford Nanopore Technologies (ONT) توسعه یافته است که توالی نوکلئوتیدها را با عبور مولکول‌های منفرد از منافذ نانومقیاس و اندازه‌گیری تغییرات در جریان الکتریکی شناسایی می‌کند.

نانوپورها فقط عبور DNA تک رشته‌ای را به صورت ترتیب خطی اجازه می‌دهند. این روش، تحلیل در زمان (real-time) را ارائه می‌دهد و می‌تواند نوکلئوتیدها را از خوانش‌های کوتاه تا فوق‌العاده طولانی توالی‌یابی کند.

روش‌های تشخیص تک مولکولی (Single-molecule detection) مانند توالی‌یابی نانوپور(nanopore sequencing) در نسل سوم فناوری‌های توالی‌یابی گنجانده شده‌اند. مفهوم توالی‌یابی نانوپور در دهه 1980 توسعه یافت در حالی که اولین دستگاه توالی‌یابی نانوپور توسط ONT در دهه 2010 توسعه یافت. دستگاه‌های ONT توالی‌یابی نانوپور را به طور گسترده در دسترس قرار داده است. این روش در مطالعات ژنومی، شناسایی پاتوژن، تحلیل اپی‌ژنتیک و زمینه‌های مختلف دیگر استفاده می‌شود.

پیشینه تاریخی توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

• در سال 1989، پروفسور دیوید دیامر برای اولین بار ایده استفاده از یک کانال پروتئینی در غشاها برای تشخیص نوکلئوتیدهای منفرد را مطرح کرد.
• در سال 1991، دیامر این ایده را با پروفسور دن برانتون از هاروارد مطرح کرد که منجر به اولین تلاش‌های تحقیقاتی مشترک در حس کردن نانوپور شد.
• آزمایش‌های اولیه با نانوپور سنسینگ (nanopore sensing) در سال 1993 با حضور پروفسور جورج چرچ در تیم همراه با چندین محقق دیگر آغاز شد. مفهوم توالی‌یابی نانوپور در سال 1996 منتشر شد.
• در سال 2001، پروفسور هاگان بیلی در دانشگاه آکسفورد یک حسگر نانوپور (nanopore sensor) کارآمد را توضیح داد. این امر منجر به تأسیس Oxford Nanopore Technologies در سال 2005 توسط پروفسور بیلی همراه با دکتر گوردون سانگهرا و دکتر اسپایک ویلکوکس شد.
• اولین داده‌های توالی‌یابی نانوپور در سال 2012 در یک کنفرانس ارائه شد که سیستم‌های MinION و GridION را معرفی کرد.
• MinION در سال 2014 از طریق برنامه دسترسی MinION(MAP) برای دسترسی کاربران اولیه راه‌اندازی شد و در سال 2015 به صورت تجاری عرضه شد.
• در سال 2016، دستگاه‌های جدید مانند SmidgION سازگار با موبایل و دستگاه آماده‌سازی نمونه خودکار VolTRAX اعلام شد.
• در سال 2017، این شرکت GridION X5 را راه‌اندازی کرد در حالی که PromethION در سال 2018 به صورت تجاری در دسترس بود.
• در سال 2019، آداپتور Flongle برای آزمایش‌های توالی‌یابی کوچک‌تر و کم‌هزینه راه‌اندازی شد.
• این شرکت در سال 2022 راه‌اندازی PromethION 2 را اعلام کرد.

اصل توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

توالی‌یابی نانوپور بر اساس این مبنا کار می‌کند که زمانی که مولکول‌های اسید نوکلئیک از یک کانال نانوپور در یک غشاء که دو محفظه پر از الکترولیت را از هم جدا می‌کند عبور می‌کنند، جریان را مختل کرده و یک سیگنال الکتریکی مشخص تولید می‌کنند. محفظه‌ای که توالی‌یابی در آن اتفاق می‌افتد، سیس ساید (cis side) نامیده می‌شود، در حالی که محفظه حاوی آنالیت، ترانس ساید (trans side) نامیده می‌شود.

سرعت انتقال توسط پروتئین‌های موتوری که وجود دارند، کنترل میشود. این پروتئین‌ها همچنین فعالیت هلیکازی دارند که DNA دو رشته‌ای را به مولکول تک رشته‌ای باز می‌کنند.

هنگامی که ولتاژ به غشاء اعمال می‌شود، یک جریان یونی تولید می‌کند. همانطور که نوکلئوتیدها از نانوپور عبور می‌کنند، بار منفی آن‌ها باعث می‌شود که به سمت آند حرکت کنند، که جریان یونی را مختل کرده و یک الگوی مشخص تولید می‌کند. نوکلئوتیدهای مختلف جریان یونی را به طور متفاوتی تحت تأثیر قرار می‌دهند و به دلیل جرم و خواص الکتریکی خود الگوهای منحصر به فردی تولید می‌کنند. این الگو تشخیص داده شده و تفسیر می‌شود تا توالی نوکلئوتیدی تعیین شود.

فرایند توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

استخراج DNA و آماده‌سازی کتابخانه

• مرحله اولیه شامل استخراج ماده ژنتیکی مورد نظر از نمونه‌های مختلف است.
• برای خوانش‌های بسیار طولانی، از روش‌های آزمایشی خاصی برای جداسازی DNA با وزن مولکولی بالا استفاده می‌شود. روش‌های مختلفی مانند استخراج ستون چرخشی (spin column)، مهره‌های مغناطیسی (magnetic bead) و فنول-کلروفرم (phenol-chloroform) برای استخراج DNA استفاده می‌شوند.
• ماده ژنتیکی استخراج شده ممکن است با استفاده از روش‌های برش فیزیکی (physical shearing) یا هضم آنزیمی به قطعات کوچک‌تر برای توالی‌یابی تقسیم شود.
• DNA قطعه شده می‌تواند تحت انتخاب اندازه اختیاری قرار گیرد تا قطعات با طول‌های خاص جداسازی شوند.
• DNA قطعه شده سپس ترمیم (اصلاح) (repaired) می‌شود تا اطمینان حاصل شود که انتهای قطعات DNA برای توالی‌یابی دقیق مناسب هستند.
• آداپتورها به انتهای قطعات DNA اضافه می‌شوند که به اتصال قطعات DNA به پروتئین‌های موتور و نانوپورها کمک می‌کنند.

فرآیند توالی‌یابی

• کتابخانه برای توالی‌یابی به یک سلول جریان معرفی می‌شود. این سلول حاوی دو محفظه پر از محلول یونی است که توسط غشایی حاوی نانوپورها از هم جدا شده‌اند.
• سلول جریان در داخل یک توالی‌یاب قرار می‌گیرد که در آن ولتاژ ثابتی اعمال می‌شود. این باعث ایجاد جریان یونی از طریق نانوپورها می‌شود.
• DNA مورد توالی‌یابی با پروتئین‌های موتوری مخلوط می‌شود که به DNA متصل می‌شوند. پروتئین موتور مارپیچ دو رشته‌ای را باز می‌کند و یک رشته را از طریق نانوپور منتقل می‌کند.
• هنگامی که DNA تک رشته‌ای از نانوپور عبور می‌کند، با جریان یونی تداخل می‌کند. هر نوکلئوتید باعث تغییر خاصی در جریان می‌شود که سیگنال‌های خاصی را تولید می‌کند. این سیگنال توسط یک تقویت‌کننده پچ-کلمپ (patch-clamp amplifier) تشخیص داده می‌شود.

تحلیل داده‌ها

• سیگنال‌ها با استفاده از الگوریتم‌های بازخوانی (base-calling algorithms) به توالی‌های DNA ترجمه می‌شوند که اندازه‌گیری‌های جریان خام را به توالی‌های نوکلئوتیدی تبدیل می‌کنند. این شامل تفسیر الگوهای خاص تغییرات جریان است. اصلاحات DNA یا RNA نیز با استفاده از بازخوانی (base calling) تشخیص داده می‌شوند.
• پس از بازخوانی (base calling) ، تصحیح خطا برای اصلاح داده‌های توالی انجام می‌شود. این خطاها را در توالی تصحیح می‌کند تا دقت داده‌های توالی‌یابی را بهبود بخشد.
• داده‌های توالی‌یابی با یک ژنوم مرجع هم‌تراز شده و مونتاژ (assemble) ژنوم انجام می‌شود.
• وارینت‌های ساختاری و مناطق تکراری پس از مونتاژ (assemble) و هم‌ترازی تشخیص داده می‌شوند.
• برای مطالعات ترانسکریپتوم، ایزوفرم‌های کامل ژن بازسازی می‌شوند و بیان ژن مطالعه می‌شود.

انواع توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

سه روش توالی‌یابی نانوپور وجود دارد:

توالی‌یابی 2D

در توالی‌یابی 2D، هم الگو و هم رشته مکمل توالی‌یابی می‌شوند. توالی‌یابی 2D یکی از روش‌های اولیه استفاده شده توسط ONT بود. یک آداپتور سنجاق سر برای اتصال دو رشته استفاده می‌شود که ابتدا توالی‌یابی رشته الگو و سپس رشته مکمل را امکان‌پذیر می‌کند. این روش دقت بالاتری را ارائه می‌دهد زیرا هر دو رشته DNA را توالی‌یابی می‌کند. با این حال، از ماه مه 2017، ONT جریان 2D سلول‌ها (2D flow cells) را حذف کرده است.

توالی‌یابی 1D

در توالی‌یابی 1D، فقط رشته الگوی DNA توالی‌یابی می‌شود. DNA به طور مستقل با یک آداپتور لیگاسیون شده و برای توالی‌یابی از نانوپور عبور می‌کند. این روش ساده‌تر و سریع‌تر از توالی‌یابی 2D است اما دقت کمتری دارد و اطلاعات جزئی‌تری را در مقایسه با روش‌های دیگر ارائه می‌دهد.

توالی‌یابی 1D²

روش  1D²بر اصول توالی‌یابی 2D بنا شده است اما از سنجاق سرها برای اتصال رشته‌ها استفاده نمی‌کند. فقط یک رشته را در یک زمان توالی‌یابی می‌کند اما از آداپتورهای خاصی استفاده می‌کند که توالی‌یابی هر دو رشته را به طور مستقل در گذرهای جداگانه از طریق نانوپور امکان‌پذیر می‌کند. بنابراین، هر دو رشته الگو و مکمل را به طور مستقل توالی‌یابی می‌کند که دقت خوانش‌ها را افزایش می‌دهد.

انواع نانوپورها

نانوپورهای مورد استفاده در توالی‌یابی می‌توانند از منابع بیولوژیکی مشتق شده یا از مواد حالت جامد سنتز شوند.

1. نانوپورهای بیولوژیکی

نانوپورهای بیولوژیکی از پروتئین‌های طبیعی مشتق می‌شوند. آن‌ها معمولاً توسط میکروارگانیسم‌ها تولید می‌شوند. این‌ها شامل پروتئین‌های غشایی مانند α-همولیزین از استافیلوکوکوس اورئوس و پروتئین پورین A مایکوباکتریوم اسمگماتیس (MspA) هستند. این منافذ بیولوژیکی به طور طبیعی کانال‌هایی تشکیل می‌دهند که می‌توانند برای توالی‌یابی DNA استفاده شوند. این نانوپورها عمر کوتاه‌تری دارند و در مقایسه با نانوپورهای حالت جامد پایدارتر هستند.

2. نانوپورهای حالت جامد (Solid-state)

نانوپورهای حالت جامد یا مصنوعی (synthetic nanopores) از مواد حالت جامد مانند نیترات سیلیکون، اکسید آلومینیوم یا نانولوله‌های کربنی ساخته می‌شوند. نانوپورهای مصنوعی می‌توانند دقیقاً مطابق نیازهای مورد نیاز برای توالی‌یابی طراحی شوند. آن‌ها با استفاده از روش‌های مختلفی ایجاد می‌شوند که کنترل خواص نانوپورها را امکان‌پذیر می‌سازد.

دستگاه‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

1. MinION

MinION یک دستگاه توالی‌یابی آکسفورد نانوپور قابل حمل و جمع و جور است. این اولین دستگاه توالی‌یابی نانوپور است که در سال 2012 معرفی شد و در سال 2015 به صورت تجاری عرضه شد. MinION می‌تواند هر طول قطعات را، از کوتاه تا بسیار طولانی، توالی‌یابی کند. این دستگاه به راحتی از طریق یک کابل USB 3.0 استاندارد به هر کامپیوتری متصل می‌شود. این دستگاه برای کاربردهای مختلف از جمله ژنوم‌های کامل، متاژنومیکس، توالی‌یابی هدفمند و تحلیل ترانسکریپتوم مناسب است.

2. GridION

GridION یک دستگاه توالی‌یابی جمع و جور رومیزی است که می‌تواند 5 جریان سلولی MinION را همزمان اجرا کند. این دستگاه به همراه MinION در سال 2012 معرفی شد و در سال 2017 عرضه شد. این دستگاه امکان انجام همزمان چندین آزمایش توالی‌یابی را فراهم می‌کند. GridION همچنین از طول خوانش‌های کوتاه تا بسیار طولانی پشتیبانی می‌کند و تعداد زیادی نمونه را به طور کارآمد مدیریت می‌کند.

3. PromethION

PromethION یک دستگاه پر بازده مناسب برای پروژه‌های بزرگ است. این دستگاه دارای 24 یا 48 سلول جریان موازی است. این دستگاه در سال 2014 معرفی شد و در سال 2018 به صورت تجاری عرضه شد. این سیستم از طیف گسترده‌ای از کاربردهای توالی‌یابی از پروژه‌های کوچک تا مطالعات مقیاس جمعیت پشتیبانی می‌کند.

4. Flongle

Flongle یک آداپتور برای MinION یا GridION است که در سال 2019 عرضه شد. این دستگاه برای آزمایش‌های توالی‌یابی کوچکتر مناسب است. Flongle به کاربران اجازه می‌دهد در صورت نیاز نمونه‌های منفرد را بدون نیاز به چندگانه‌سازی اجرا کنند. این دستگاه در توالی‌یابی آمپلیكون، کنترل کیفیت و سایر آزمایش‌های کوچک توالی‌یابی کاربرد دارد.

مزایای توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

• توالی‌یابی آکسفورد نانوپور داده‌های در زمان (real-time) ارائه می‌دهد و می‌تواند به هر اندازه دستگاهی مقیاس شود که برای نیازهای آزمایشی مختلف مناسب باشد.
• دستگاه‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور مانند MinION جمع و جور و قابل حمل هستند که توالی‌یابی حتی خارج از محیط‌های آزمایشگاهی سنتی را امکان‌پذیر می‌سازد.
• این دستگاه‌ها همچنین شامل دستگاه‌هایی هستند که آماده‌سازی سریع کتابخانه را امکان‌پذیر می‌کنند که فرآیند توالی‌یابی را سرعت می‌بخشد.
• پارامترهای مختلف در توالی‌یابی آکسفورد نانوپور مانند مدت زمان آزمایش، دستگاه استفاده شده و تعداد جریان سلول‌ها استفاده شده می‌توانند با نیازهای تحقیقاتی خاص تنظیم شوند.
• دستگاه‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور می‌توانند قطعات طولانی DNA را توالی‌یابی کنند که از طول خوانش‌های بسیار طولانی پشتیبانی می‌کنند.
• خوانش‌های طولانی مونتاژ (assemble) ژنوم را ساده می‌کنند. توالی‌یابی آکسفورد نانوپور می‌تواند مستقیماً DNA یا RNA بومی را بدون تکثیر PCR توالی‌یابی کند که خطا را کاهش می‌دهد.

محدودیت‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

• توالی‌یابی نانوپور در مقایسه با سایر فناوری‌های توالی‌یابی دارای نرخ خطای بالاتری است زیرا تفسیر دقیق اختلالات جریان یونی ایجاد شده توسط نوکلئوتیدهایی که از نانوپور عبور می‌کنند دشوار است.
• یکی دیگر از محدودیت‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور نیاز به مقادیر زیادی از ماده اسید نوکلئیک ورودی است.
• داده‌های توالی‌یابی نانوپور می‌توانند پیچیده باشند. ابزارهای پیشرفته بیوانفورماتیک و منابع محاسباتی برای تفسیر دقیق داده‌ها مورد نیاز هستند.
• این دستگاه دارای بازده پایین‌تری است که کاربردهای آن را در مطالعات مقیاس بزرگ محدود می‌کند.
• توالی‌یابی نانوپور می‌تواند نسبت به آماده‌سازی نمونه و آلودگی حساس باشد. تولید مداوم خوانش‌های بسیار طولانی می‌تواند دشوار باشد و عواملی مانند کیفیت DNA ممکن است بر طول خوانش‌ها تأثیر بگذارند.

کاربردهای توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

• قابلیت خوانش طولانی توالی‌یابی آکسفورد نانوپور در شناسایی و مطالعه واریانت‌های ژنتیکی و ایزوفرم‌های جدید کمک می‌کند. این امر در درک شرایط و بیماری‌های ژنتیکی پیچیده مفید است.
• توالی‌یابی نانوپور برای مطالعه تغییرات ساختاری در ژنوم‌های سرطان استفاده می‌شود که برای تشخیص و نظارت بر سرطان مهم است.
• توالی‌یابی نانوپور می‌تواند در شناسایی میکروارگانیسم‌ها استفاده شود. این امر در طبقه‌بندی و نظارت بر میکروب‌ها کمک می‌کند. همچنین در تشخیص پاتوژن و پروفایل مقاومت آنتی‌بیوتیکی برای شناسایی ژن‌های مقاومت از نمونه‌های بالینی و نظارت بر شیوع بیماری‌های عفونی استفاده می‌شود.
• توالی‌یابی نانوپور می‌تواند برای مونتاژ (assemble) مناطق بسیار تکراری و تغییرات ساختاری منجر به مونتاژ کامل‌تر ژنوم استفاده شود. توالی‌یابی نانوپور می‌تواند اصلاحات DNA مانند الگوهای متیلاسیون را تشخیص دهد که برای درک اصلاحات اپی‌ژنتیکی مفید است. دستگاه‌های ONT مانند MinION قابل حمل هستند که تحقیقات میدانی مانند شناسایی میکروب‌ها در رودخانه‌های آلوده و آفات در مزارع کشاورزی را امکان‌پذیر می‌سازند.

همچنین بخوانید:

• NGS چیست؟
• توالی یابی ایلومینا چیست؟
• توالی یابی DNA به روش سنگر + ویدیو آموزشی

مترجم: محمد صادق محمودی لرد

منبع