مقدمه‌ای بر آزمایش MPN
آزمایش بیشترین تعداد احتمالی (MPN) یک روش آماری و کمی در میکروبیولوژی است که برای برآورد غلظت میکروارگانیسم‌های زنده (معمولاً باکتری‌های کلیفرم ) در نمونه‌های مایع استفاده می‌شود. این روش به طور گسترده در آنالیز آب، غذا، شیر و فاضلاب برای تشخیص کلیفرم ها، کلیفرم های مدفوعی و اشریشیا کلی به عنوان شاخص آلودگی میکروبی استفاده می‌شود.
MPN به ویژه برای آنالیز نمونه‌هایی با شمار کم باکتری که با روش‌های شمارش کلنی کانت ممکن است عملی نباشند مناسب می باشد. این آزمایش بر اساس حضور یا عدم حضور رشد باکتریایی در یک سری رقیق‌سازی‌های متوالی استوار است.
اصل تست MPN
آزمایش MPN یک تکنیک مبتنی بر احتمالات است که جمعیت باکتریایی در یک نمونه را با استفاده از رقیق‌سازی متوالی و تشخیص رشد تفریقی در یک محیط مایع برآورد می‌کند.
چندین لوله با نمونه رقیق شده به صورت متوالی تلقیح می‌شوند.
رشد با استفاده از نشانگرها (تشکیل گاز، تغییر رنگ، کدورت) تعیین می‌شود.
تعداد لوله‌های مثبت با جدول MPN مقایسه می‌شود تا تراکم باکتریایی (MPN/100 mL) برآورد شود.
انواع آزمایش MPN
- آزمایش احتمالی (Initial Screening)
- آزمایش تأیید شده (Confirmation of Coliforms)
- آزمایش کامل شده (Final Identification)
مواد و تجهیزات مورد نیاز
مواد شیمیایی و محیط کشت
- محیط لاکتوز براث (LB) یا لوری تریپتوز براث (LTB) برای آزمایش احتمالی
- محیط لاکتوز بریلینت گرین بایل (BGLB) برای آزمایش تأیید شده
- محیط EC برای تأیید کلیفرم های مدفوعی در دمای
- آگار ائوزین متیلن بلو (EMB) برای آزمایش کامل شده.
- لوله‌های دورهام (برای تشخیص تولید گاز)
تجهیزات
- اتوکلاو (برای استریلیزاسیون)
- پیپت‌ها و میکروپیپت‌های استریل
- لوله‌های آزمایش استریل (در مجموعه‌های 10 میلی‌لیتری) با درپوش
- انکوباتور
- شعله یا هود لامینار
- جدول MPN مرجع استاندارد برای تفسیر
مراحل گام به گام برای آزمایش MPN
آماده‌سازی نمونه و رقیق‌سازی متوالی
- نمونه آب، شیر یا غذا را در یک ظرف استریل جمع‌آوری کنید.
- به خوبی مخلوط کنید و رقیق‌سازی‌های متوالی را آماده کنید (مثلاً 1:10، 1:100، 1:1000).
- 10 میلی‌لیتر، 1 میلی‌لیتر و 0.1 میلی‌لیتر از هر رقیق‌سازی را به لوله‌های آزمایش حاوی محیط لاکتوز براث (LB) و لوله‌های دورام منتقل کنید.
آزمایش احتمالی
هدف: تشخیص باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز که گاز تولید می‌کنند.
- لوله‌ها را در دمای 35 درجه به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه کنید.
- تشکیل گاز در لوله‌های دورام را مشاهده کنید (نتیجه مثبت: حباب‌های گاز).
- تعداد لوله‌های مثبت را برای هر رقیق‌سازی شمارش کنید.
- از جدول MPN برای تعیین تراکم باکتریایی (MPN/100 mL) استفاده کنید.
آزمایش تأیید شده
هدف: تأیید حضور کلیفرم ها با استفاده از محیط‌های انتخابی.
- یک لوپ از لوله‌های مثبت را به محیط لاکتوز بایل بریلینت گرین (BGLB) منتقل کنید.
- در دمای 35درجه به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه کنید.
- تولید گاز در لوله‌های دورام را مشاهده کنید (مثبت: کلیفرم ها حضور دارند).
برای تأیید کلیفرم های مدفوعی:
- به محیط EC منتقل کنید و در دمای 44.5درجه به مدت 24 ساعت انکوبه کنید.
- تشکیل گاز در لوله دورهام = مثبت برای کلیفرم های مدفوعی.
آزمایش کامل شده (برای تأیید اشریشیاکلی)
هدف: شناسایی قطعی کلیفرم ها.
- یک لوپ از لوله‌های مثبت BGLB را روی آگار اوزین متیلن بلو (EMB) کشت دهید.
- در دمای 35درجه به مدت 24 ساعت انکوبه کنید.
- ویژگی‌های کلنی را مشاهده کنید:
- اشریشیا کلی: جلای فلزی سبز (مثبت).
- انترو باکتر: کلنی‌های موکوئید صورتی.
- رنگ‌آمیزی گرم و آزمایش‌های بیوشیمیایی مانند اندول، MR، VP، سیترات را برای تأیید نهایی انجام دهید.
تفسیر نتایج تست MPN
- از جدول MPN برای تعیین شمار باکتریایی از لوله‌های مثبت استفاده کنید.
- به عنوان MPN در هر 100 میلی‌لیتر نمونه گزارش کنید.
کاربردهای آزمایش MPN
- آنالیز کیفیت آب: تشخیص کلیفرم ها در آب آشامیدنی، دریاچه‌ها و فاضلاب.
- میکروبیولوژی مواد غذایی: آنالیز آلودگی شیر، محصولات لبنی، آبمیوه‌ها.
- آزمایش‌های دارویی: ارزیابی بار باکتریایی در محصولات استریل.
- میکروبیولوژی محیطی: مطالعات آلودگی رودخانه‌ها و فاضلاب.
محدودیت‌های تست MPN
- کارآمدی کم در مقایسه با روش‌های مولکولی مدرن.
- برخلاف تکنیک‌های سریع مستقل از کشت مانند , PCR qPCR نتایج به بیش از 48 ساعت زمان نیاز دارد
- برای غلظت‌های بسیار کم باکتری دقیق نیست.
نتیجه‌گیری
آزمایش MPN یک روش کمی ارزشمند برای برآورد جمعیت باکتریایی است، به ویژه برای کلیفرم ها در نمونه‌های آب، غذا و محیطی. علیرغم وجود جایگزین‌های سریع‌تر مدرن این روش یک استاندارد طلایی در آزمایش‌های میکروبی آب است.
همچنین بخوانید:
مرسی از زحماتتون
با سلام و احترام.
با توجه به اینکه این روش یک روش بر مبنای قانون احتمالات است و تصور بر این است که کلی فرم به طور یکنواخت در نمونه پخش شده است، چرا نتایج به این صورت است که تنها بعضی از لوله ها در ست ۳ تایی یا ۵ تایی مثبت می شوند؟ مگر این ستها تکرار نیستند؟ پس با توجه به توزیع یکنواخت کلی فرم در نمونه مایع آیا نباید این طور باشد که تو هر ست یا همه لوله ها باید مثبت شوند یا منفی؟
خیر در قانون احتمالات صفر مطلق و یکنواختی مطلق وجود ندارد. بنابراین با هر نمونه برداری در هر لوله قانون 0 و 1 دخیل بوده احتمال مثبت و منفی بودن در بین لوله ها به یک اندازه میباشد
توضیحات خوبیه ولی واسه کسی که از قبل میدونه mpn چیه
روش MPN بيشتر برای شمارش کلی فرم های آب، شير و فرآورده های آن به کار می رود.به دليل اين که در مواد غذايی جامد امکان توزيع يکنواخت ارگانيسم ها بعيد است، اين روش کاربرد چندانی ندارد. و کارایی روشها بسته به شرایط دارد
عالییییی بود بخصوص آزمایشگاه که امکاناتش تکمیله و اساتید همه چی تموم داره
سلام مرسی از نظرتون
رشته من کشاورزی هست میتونم در این دوره شرکت کنم آیا برام مجاز هست؟
سلام بله میتونه براتون کاربردی باشه
نمونه برداری ها دقیق بوده و با راهنمایی اساتید مرحله به مرحله طی شد و این در روند یادگیری بسیار امری مهم و اثرگذاره
سطح تدریس و شرکت در دوره ها پیشرفته رو به بالاست و حس میکنم سطح اطلاعاتم خیلی بیشتر شده نسبت به قبل از شرکت در دوره.
آزمونها هم خوب و هر جامع هستند و من که خیلی راضی بودم