تست ویدال: مقدمه، اصول، روش استفاده، تفسیر نتایج و محدودیتها

تست ویدال چیست؟

• تست ویدال نوعی آزمایش آگلوتیناسیون است که وجود آگلوتینین‌های سرم (H و O) را در سرم بیماران مبتلا به تب تیفوئید و پاراتیفوئید تشخیص می‌دهد.
• هنگامی که امکانات لازم برای کشت در دسترس نیست، تست ویدال قابل اعتماد است و می‌تواند در تشخیص تب تیفوئید در مناطق آندمیک مفید باشد.
• تست ویدال توسط Georges Ferdinand ویدال در سال 1896 توسعه یافت.
• سرم بیمار برای آنتی بادی های O و H (آگلوتینین‌ها) در برابر سوسپانسیون‌های آنتی ژن زیر (معمولاً سوسپانسیونهای رنگ آمیزی شده) آزمایش می‌شود:

1. Typhi 0 antigen suspension, 9, 12
2. Typhi H antigen suspension, d
3. Paratyphi A 0 antigen suspension, 1, 2, 12
4. Paratyphi A H antigen suspension, a
5. Paratyphi B 0 antigen suspension, 1, 4, 5, 12
6. Paratyphi B H antigen suspension, b, phase 1
7. Paratyphi C 0 antigen suspension, 6, 7
8. Paratyphi C H antigen suspension, c, phase 1

• آنتی بادی سالمونلا در پایان هفته اول در سرم ظاهر می‌شود و در هفته سوم تب آندمیک به شدت افزایش می یابد. در تب حاد تیفوئید، آگلوتینین O معمولاً 6 تا 8 روز پس از شروع تب و اگلوتینین H پس از 10 تا 12 روز قابل تشخیص است.
• برای نشان دادن افزایش تیتر آنتی بادی، ترجیحاً دو نمونه سرم با فاصله 7 تا 10 روز آزمایش شود.
• سوسپانسیون آنتی ژن سالمونلا را میتوان با استفاده از تکنیکهای اسلاید و لوله ‌آزمایش استفاده کرد.

اصول تست ویدال

سوسپانسیون باکتریایی که حامل آنتی ژن است، در مواجهه با آنتی بادی‌های سالمونلا، آگلوتینه می‌شود. بیماران مبتلا به تب روده، در سرم خود آنتی بادی‌هایی دارند که می‌توانند واکنش دهند و رقت‌های دوبرابر شدن سریال آنتی ژن‌های سالمونلای رنگی و کشته شده را در آزمایش، آگلوتینه کنند.

اساس آزمایش ویدال این است که اگر آنتی بادی همولوگ در سرم بیماران وجود داشته باشد، با آنتی ژن مربوطه در معرف واکنش داده و  آگلوتیناسیون در لوله ایجاد می‌شود. آنتی ژنهای مورد استفاده در آزمایش آنتی ژن های “H” و “O” سالمونلا تیفی و آنتی ژن

“H” S. Paratyphi هستند. آنتی ژن “O” پاراتیفوئید استفاده نمی‌شود زیرا آنها با آنتی ژن تیفوئید “O” به دلیل اشتراک فاکتور 12 واکنش متقابل دارند. آنتی ژن “O” آنتی ژنی سوماتیک و آنتی ژن “H” آنتی ژن تاژک است.

وسایل مورد نیاز برای آزمایش ویدال

1. سرم بیمار: نمونه خون بیمار که سانتریفیوژ شده و سرم آن جدا شده است.
2. آنتی‌ژن‌های تست ویدال:
   • آنتی‌ژن‌های O و H برای سالمونلا تیفی
   • آنتی‌ژن‌های AH و BH برای سالمونلا پاراتیفی A و B
3. لوله‌های آزمایش: برای انجام رقیق‌سازی سریالی.
4. پیپت‌های مدرج یا میکروپیپت: برای اندازه‌گیری و انتقال دقیق مایعات.
5. کارت تست (اسلاید) یا پلیت میکروتیتر: برای انجام تست سریع (در صورت استفاده از روش اسلاید).
6. آب مقطر یا سالین: برای رقیق‌سازی سرم و آنتی‌ژن‌ها.
7. انکوباتور: برای انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‌گراد (در صورت استفاده از روش لوله‌ای).
8. میله همزن یا اپلیکاتور چوبی: برای مخلوط کردن آنتی‌ژن‌ها و سرم (در صورت استفاده از روش اسلاید).
9. سانتریفیوژ: برای جدا کردن سرم از نمونه خون (در صورت لزوم).
10. دستکش و وسایل حفاظتی: برای اطمینان از ایمنی کاربر.

تهیه آنتی ژنهای ویدال

• سوسپانسیون H باکتری با افزودن 0.1 درصد فرمالین به کشت 24 ساعته broth یا سوسپانسیون سالین یک کشت آگار تهیه می‌شود.
• برای تهیه سوسپانسیون O از باکتری‌ها، ارگانیسمها بر روی فنل آگار (1:800) کشت می‌شوند تا تاژکها را مهار کنند.
• از سویه‌های صاف و استاندارد ارگانیسم استفاده می‌شود. برای این منظور از سویه‌های S Typhi 901، O و H استفاده می‌شود.
• سپس کشت در حجم کمی از نمک، امولسیون می‌شود، با الکل به اندازه 20 برابر حجم کشت، مخلوط می‌شود، در دمای 40 درجه سانتیگراد تا 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه حرارت داده می‌شود و در نهایت باید سانتریفیوژ شود.
• آنتی ژنها با کلروفرم (نگهدارنده) تیمار شده و رنگهای مناسب برای شناسایی آسان آنتی ژن ها اضافه می‌شود.

مراحل تست ویدال

تست اسلاید

1. یک قطره از کنترل مثبت را روی لام قرار دهید.
2. یک قطره از سالین ایزوتونیک را روی قسمت دیگری از لام با پیپت قرار دهید.
3. یک قطره از سرم بیمار را که باید آزمایش شود، روی چهار قسمت از لام بریزید.
4. یک قطره از سوسپانسیون آنتی ژن H را به دو قطره مرحله اول و دوم اضافه کنید. (PC و NC).
5. هر کدام از آنتی ژنهای «O»، «H»، AH»» و «BH» را به اندازه یک قطره به چهار قطره از سرم بیمار اضافه کنید.
6. محتویات را به طور یکنواخت با میله‌های همزنmixing sticks، جداگانه مخلوط کنید.
7. اسلاید را به آرامی به سمت جلو و عقب تکان دهید و بعد از گذشت یک دقیقه، آگلوتیناسیون را به صورت ماکروسکوپی مشاهده کنید.

روش نیمه کمی

1. یک قطره از سالین ایزوتونیک را روی اسلاید بریزید و سپس 5، 10، 20، 40، 80 میکرومول از نمونه آزمایش را روی قسمتهای باقی مانده از اسلاید قرار دهید.
2. به هر قطره، یک قطره از آنتی ژن که آگلوتیناسیون را با نمونه آزمایش در روش غربالگری نشان داد، اضافه کنید.
3. با استفاده از میله همزن جداگانه، محتویات را به طور یکنواخت مخلوط کنید.
4. اسلاید را به آرامی به سمت جلو و عقب تکان دهید، در عرض یک دقیقه آگلوتیناسیون را به صورت ماکروسکوپی مشاهده کنید.

روش تست با لوله آزمایش استاندارد

در تست ویدال، در ابتدا از دو نوع لوله آزمایش استفاده شد:

(1) لوله آزمایش درایر ( لوله آزمایش باریک و کف مخروطی) برای آگلوتیناسیون H و

(2) لوله آزمایش فلیکس (لوله آزمایش ته گرد و کوتاه) برای آگلوتیناسیون O.

امروزه از لوله آزمایشهای کان 3×0.5 میلی لیتری برای هر دو نوع آگلوتیناسیون استفاده می‌شود.

1. 4 مجموعه از 8 لوله آزمایش (کان) آزمایش را بردارید و آنها را از 1 تا 8 برای تشخیص آنتی بادی O، H، AH و BH شماره گذاری کنید.
2. 1.9 میلی لیتر سالین ایزوتونیک را در لوله آزمایش شماره 1 تمام آنتی بادی‌ها با پیپت اضافه کنید.
3. به هر یک از لوله‌های آزمایش باقی مانده (شماره‌های 2 تا 8) 1.0 میلی لیتر سالین ایزوتونیک اضافه کنید.
4. به لوله آزمایش شماره 1 در هر ردیف 0.1 میلی لیتر از نمونه سرم مورد آزمایش اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.
5. 1.0 میلی لیتر از سرم رقیق شده را از لوله آزمایش شماره 1 به لوله آزمایش شماره 2 انتقال دهید و خوب مخلوط کنید.
6. 1.0 میلی لیتر از نمونه رقیق شده را از لوله آزمایش شماره 2 به لوله آزمایش شماره 3 انتقال دهید و خوب مخلوط کنید. این رقت را تا لوله آزمایش شماره 7 در هر آنتی بادی ادامه دهید.
7. 1.0 میلی لیتر از سرم رقیق شده را از لوله آزمایش شماره 7 هر مجموعه، دور بریزید.
8. لوله آزمایش شماره 8 در تمام مجموعه‌ها به عنوان کنترل کننده سالین عمل می‌کند. اکنون رقت نمونه سرم بدست آمده در هر مجموعه به شرح زیر است: شماره لوله آزمایش : 1 2 3 4 5 6 7 8 (کنترل) رقت 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1 :1280.
9. به تمام لوله‌های آزمایش (1 تا 8) هر مجموعه یک قطره از سوسپانسیون آنتی ژن ویدالTEST مربوطه (O، H، AH و BH) را از ویالهای معرف اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.
10. لوله‌های آزمایش را بپوشانید و در دمای 37 درجه سانتیگراد یک شب (تقریباً 18 ساعت) انکوبه کنید.
11. قسمت زیرین که ته نشین شده را به آرامی خارج کرده و آگلوتیناسیون را مشاهده کنید.

تفسیر تست ویدال

تست اسلاید

• آگلوتیناسیون نتیجه آزمایش مثبت است و اگر واکنش مثبت با 20ul از نمونه آزمایش مشاهده شود، نشان دهنده وجود میزان قابل توجهی از آنتی بادی مربوطه در سرم بیمار است.
• عدم آگلوتیناسیون نتیجه آزمایش منفی است و نشان دهنده عدم وجود میزان قابل توجه از آنتی بادی مربوطه، در سرم بیمار است.

روش لوله آزمایش

• تیتر سرم بیمار با استفاده از سوسپانسیون آنتی ژن تست ویدال، بالاترین رقت نمونه سرم آگلوتیناسیون قابل مشاهده ایجاد می‌کند.
• نمونه‌ای که تیتر 1:100 و بیشتر را برای آگلوتیناسیون O و 1:200 و بیشتر برای آگلوتیناسیون H را نشان می‌دهد، باید از نظر بالینی مهم (عفونت فعال) در نظر گرفته شود. مثال: در شکل بالا، تیتر 160 است.
• آگلوتیناسیون H قابل اعتمادتر از آگلوتینین O است.
• آگلوتینین در پایان هفته اول مشخص و در هفته دوم و سوم با افزایش شدید در سرم ظاهر می‌شود و تیتر آن تا هفته چهارم ثابت می‌ماند و پس از آن کاهش می‌یابد.

محدودیت‌های تست ویدال

• آزمایش ویدال زمان‌بر است (برای یافتن تیتر آنتی بادی) و هنگامی که تشخیص داده می‌شود، برای شروع دوره درمانی آنتی بیوتیک، خیلی دیر است.
• تست ویدال باید در پرتو تیترهای مرجع در جمعیت محلی سالم تفسیر شود.
• تست ویدال ممکن است در بیمارانی که قبلاً واکسیناسیون شده‌اند یا عفونت با S. Typhi داشته‌اند، مثبت کاذب باشد.
• این آزمایش نمی‌تواند بین عفونت فعلی و عفونت قبلی یا واکسیناسیون علیه تیفوئید تمایز قائل شود(علاوه بر واکنش با سایر گونه‌های سالمونلا).
• تیترهای گسترده نیز در ارتباط با دیسگاماگلوبولینمی هپاتیت فعال مزمن و سایر بیماری‌های خودایمنی گزارش شده است.
• نتیجه مثبت کاذب در تیفوس، مالاریا حاد فالسیپاروم(به ویژه در کودکان)، بیماری مزمن کبدی همراه با افزایش سطح گلوبولین و اختلالاتی مانند آرتریت روماتوئید، میلوماتوز و سندرم نفروتیک نیز ایجاد می‌شود.
• نتیجه منفی کاذب ممکن است بخاطر درمان زودهنگام، وجود ارگانیسم‌های پنهان در استخوان و مفاصل، و عود تب حصبه باشد. گاهی اوقات سویه‌های عفونی، ایمنی زایی ضعیفی دارند.
• تست‌های ویدال منفی کاذب ممکن است به دلیل اختلال در پاسخ آنتی بادی در درمان ضد میکروبی اولیه و یا به دنبال عود تیفوئید باشد.
• هیپوپروتئینمی شدید همچنین ممکن است از افزایش تیتر آنتی بادی 0 و H جلوگیری کند.

با این حال، سطوح آنتی بادی موجود در یک جمعیت سالم ممکن است در دوره‌های زمانی و در مناطق مختلف متفاوت باشد که این امر ایجاد یک سطح مشخص از آنتی بادی به عنوان مرجع را در یک منطقه و جامعه دشوار می‌کند.

• در نواحی اندمیک تیفوئید(به میزان اندک)، پاسخ‌های آنتی بادی O و H به صورت ضعیف و تاخیری، سودمندی تست ویدال را محدود می‌کند. همچنین در بین آزمایشگاه‌ها، در مورد عملکرد و خواندن نتایج تست‌ ویدال تفاوت‌هایی وجود دارد که اطمینان آزمایش را از بین می‌برد.
• سازمان بهداشت جهانی (WHO) اعلام کرده‌است که به دلیل وجود عوامل مختلف تاثیرگذار بر نتایج آزمایش ویدال، بهتر است به این آزمایش اعتماد نکنید.

 همچنین بخوانید:

• تست آگلوتیناسیون لاتکس: اهداف، اصول، کاربرد و تفسیر نتایج
• آزمایش VDRL چیست؟ اصول، مراحل و تفسیر نتایج
• تست ONPG: اصول، روش، نتایج و موارد استفاده

مترجم: معصومه قریبی ششده

 منبع