تست هیدرولیز کازئین: اصول، روش، کاربرد و تفسیر

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر تست هیدرولیز کازئین (Casein Hydrolysis)

کازئین به عنوان پروتئین اصلی شیر، یک ماکرومولکول (Macromolecule) متشکل از زیر واحدهای اسید آمینه است که توسط پیوندهای پپتیدی (CO-NH) به یکدیگر متصل شده اند. کازئین حدود 85 درصد از پروتئین موجود در شیر و همچنین رنگ سفید آن را تشکیل می‌دهد.

کازئین بسیار بزرگتر از آن است که وارد غشای سلولی شود. قبل از جذب در سلول، پروتئین‌ها باید مرحله به مرحله تجزیه شده و به پپتون‌ها (Peptone)، پلی‌پپتیدها (Polypeptide)، دی‌پپتیدها (Dipeptide) و در نهایت به بلوک‌های سازنده خود یعنی اسیدهای آمینه تبدیل شود.

این تجزیه توسط آنزیم‌های خارج سلولی به نام پروتئازها (Protease) صورت می‌پذیرد. کار این پروتئازها شکافتن پیوند پپتیدی CO-NH با وارد کردن آب به مولکول است. سپس این واکنش اسیدهای آمینه با وزن مولکولی کم را که می‌توانند وارد غشای سلولی جهت استفاده در سنتز در ساختار و عملکرد پروتئین‌های سلولی شوند، آزاد می‌کند.

اهداف تست هیدرولیز کازئین

برای تعیین توانایی ارگانیسم در تجزیه پروتئین کازئین
جهت افتراق ارگانیسم بر اساس توانایی تولید آنزیم خارج سلولی پروتئیناز (Proteinase) (کازئیناز (Caseinase))

اصول تست هیدرولیز کازئین

برخی از میکروارگانیسم‌ها با تولید آنزیم خارج سلولی پروتئولیتیک (Proteolytic) به نام پروتئیناز (کازئیناز) توانایی تجزیه پروتئین کازئین را دارند. برای نشان دادن چنین فعالیتی در آزمایشگاه از میلک آگار (Milk agar) استفاده می‌شود. محیط کشت از نوترینت آگار (Nutrient agar) که شیر به آن اضافه شده، تشکیل شده که حاوی سوبسترای (Substrate) پروتئینی کازئین است.

مانند سایر پروتئین‌ها، پروتئین شیر یک سوسپانسیون کلوئیدی است که به محیط کشت رنگ و کدورت می‌بخشد زیرا به جای پراکنده کردن پرتوهای نور، سبب شکست آن‌ها می‌شود.

پس از تلقیح (Inoculation) و انکوباسیون (Incubation) کشت‌های پلیت آگار، ارگانیسم‌های ترشح کننده پروتئاز، ناحیه پروتئین‌کافت یا پروتئولیز (Proteolysis) را با ایجاد یک ناحیه شفاف اطراف محل رشد باکتری نشان می‌دهند. این کاهش کدورت نتیجه یک واکنش آبکافتی (Hydrolytic) است که اسیدهای آمینه محلول و غیرکلوئیدی تولید می‌کند و نشان دهنده یک واکنش مثبت است.

در غیاب فعالیت پروتئاز، محیط اطراف محل رشد ارگانیسم کدر باقی می‌ماند که نشان دهنده یک واکنش منفی است.

محیط کشت مورد استفاده در تست هیدرولیز کازئین

اسکیم میلک آگار (Skim milk agar)

پودر SM برابر 28 گرم در لیتر، تریپتون 5 گرم در لیتر، عصاره مخمر 2.5 گرم در لیتر، دکستروز (گلوکز) 1 گرم در لیتر، آگار 15 گرم در لیتر.

روش انجام تست هیدرولیز کازئین

ارگانیسم را به صورت خط مستقیم یا زیگزاگ روی پلیت تلقیح کنید.
پلیت را در دمای 25 درجه سانتیگراد یا 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
کشت‌های میلک آگار پلیت را از نظر وجود یا عدم وجود یک ناحیه شفاف یا ناحیه پروتئین‌کافت در اطراف محل رشد هر یک از ارگانیسم‌های آزمایشی باکتریایی، بررسی کنید.

تفسیر نتیجه

تست مثبت: شفافیت در اطراف و/یا زیر محل رشد کلنی مشاهده می‌شود (هیدرولیز)
تست منفی: هیچ شفافیتی در اطراف و/یا زیر محل تلقیح مشاهده نمی‌شود

کاربردها

برای شناسایی باکتری‌هایی که در شیر رشد می‌کنند مفید است.
افتراق بین انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae)، باسیلاسه (Bacillaceae) و چندین خانواده دیگر.
برای افتراق اکتینومیست‌های (Actinomycete) هوازی بر اساس فرایند پروتئین‌کافت کازئین.
شناسایی ارگانیسم‌هایی که می‌توانند کازئین را هیدرولیز کنند، مانند استرپتومایسس (Streptomyces)، سودوموناس (Pseudomonas) و اکتینومادورا (Actinomadura).