تست میلون (Millon’s Test): تعریف، اصول، روش، نتیجه و موارد استفاده

تعریف تست میلون

تست میلون یک آزمایش تحلیلی است که برای شناسایی اسید آمینه تیروزین (Tyrosine) (که تنها اسید آمینه حاوی گروه فنول (Phenol) است) استفاده می‌شود. تست میلون یک آزمایش مخصوص شناسایی تیروزین است، اما آزمایش مخصوص شناسایی پروتئین نیست، زیرا گروه فنولی موجود در سایر ترکیبات را نیز شناسایی می‌کند.

بنابراین در حین انجام تست میلون، ضروری است که تست‌های دیگری مانند تست بیوره (Biuret) و تست نین‌هیدرین (Ninhydrin) نیز انجام شود. از آن‌جایی که بسیاری از پروتئین‌ها از تیروزین تشکیل شده‌اند، این تست در تشخیص چنین پروتئین‌هایی مفید است. این تست توسط شیمی‌دان فرانسوی Auguste Nicolas Eugene Millon کشف و به نام او نام‌گذاری شد.

اهداف تست میلون

• برای تشخیص وجود پروتئین‌های حاوی تیروزین در یک نمونه مشخص.
• برای تشخیص وجود ترکیبات حاوی فنول.
• برای افتراق تیروزین از سایر اسیدهای آمینه.

اصول تست میلون

تست میلون بر اساس اصل نیتریفیکاسیون (Nitrification) گروه فنول در تیروزین است که پس از این فرآیند، با فلزات سنگین مانند جیوه کمپلکس تشکیل می‌دهد. شناساگر مورد استفاده برای تست، شناساگر میلون (Millon’s reagent) نام دارد و از نیترات جیوه و نیترات جیوه با ظرفیت 1 که در اسید نیتریک غلیظ حل شده، تشکیل شده است.

در این تست گروه فنول در مولکول تیروزین، توسط اسید نیتریک موجود در شناساگر به نیترات تبدیل می‌شود. سپس تیروزین نیترات شده با یون‌های جیوه موجود در محلول ترکیب می‌شود و یک رسوب یا محلول قرمز رنگ ایجاد می‌کند.

در برخی از پروتئین‌های حاوی تیروزین، واکنش اولیه بین نیترات جیوه منجر به ایجاد یک رسوب سفید یا زرد رنگ می‌شود. اما پس از افزودن اسید نیتریک و حرارت دادن آن، رسوب به رنگ قرمز در می‌آید. هر دوی این نتایج به عنوان نتایج مثبت در نظر گرفته شده و نشان‌دهنده وجود تیروزین در محلول هستند.

نیازمندی‌ها

شناساگر

• شناساگر میلون: شناساگر میلون از نیترات جیوه و نیترات جیوه با ظرفیت 1 حل شده در اسید نیتریک و آب مقطر تشکیل شده است.

آماده‌سازی شناساگر میلون: 160 گرم نیترات جیوه و 160 گرم نیترات جیوه با ظرفیت 1 را در 400 میلی‌لیتر محلول اسید نیتریک غلیظ حل کنید. سپس شناساگر را با افزودن 600 میلی‌لیتر آب مقطر به 1000 میلی‌لیتر برسانید. این فرمول را می‌توان با توجه به پارامترهای عملکردی تنظیم کرد.

• نمونه (تیروزین 1 درصد)

تجهیزات مورد نیاز

• لوله‌های آزمایش
• پایه لوله آزمایش
• پیپت‌ها (Pipette)
• بن‌ماری (Water bath)

روش تست میلون

1. حدود 2 میلی‌لیتر از محلول نمونه یا محلول تیروزین 1 درصد را در یک لوله آزمایش بریزید.
2. به آن حدود 2 میلی‌لیتر از شناساگر میلون اضافه کنید. اگر رسوب قرمز رنگ بلافاصله مشاهده نشد، لوله‌های آزمایش را به مدت 2 دقیقه در بن‌ماری بگذارید.
3. سپس لوله‌ها را از نظر تشکیل رسوب رنگی بررسی کنید.

نتیجه و تفسیر آزمون میلون

• نتیجه مثبت: نتیجه مثبت در تست میلون با تشکیل یک رسوب رنگی قرمز یا صورتی رنگ به دست می‌آید. این امر نشان دهنده وجود تیروزین یا پروتئین حاوی تیروزین می‌باشد.
• نتیجه منفی: نتیجه منفی در تست میلون با عدم وجود رسوب رنگی در لوله آزمایش ثابت می‌شود. این امر نشان دهنده عدم وجود تیروزین یا پروتئین حاوی تیروزین است.

موارد استفاده از تست میلون

• تست میلون جهت شناسایی پروتئین‌های حاوی تیروزین در یک نمونه مشخص استفاده می‌شود.
• این تست همچنین به افتراق تیروزین از سایر اسیدهای آمینه کمک می‌کند.
• این تست در شناسایی پروتئین کازئین (Casein) و پروتئین موجود در گوشت خام مفید است.

محدودیت‌ها

• ترکیباتی مانند اسید سالیسیلیک (Salicylic acid) و ترکیبات فنولیک در این تست نتیجه مثبت می‌دهند. بنابراین از هر گونه ترکیب فنول دیگری که ممکن است در لوله آزمایش وجود داشته باشد، باید اجتناب شود. تست‌هایی مانند تست بیوره و تست نین‌هیدرین باید برای تایید نتایج انجام شود.
• وجود کلر در محلول ممکن است در واکنش تداخل ایجاد کند. بنابراین تست را نمی‌توان بر روی نمونه حاوی کلرید انجام داد.
• ممکن است بلافاصله پس از افزودن شناساگر میلون، تشکیل یک رسوب سفید یا زرد به دلیل دناتوره شدن پروتئین‌ها توسط یون‌های جیوه مشاهده شود.

همچنین بخوانید:

• تست ارلیخ (Ehrlich Test): تعریف، اصول، روش، نتایج و موارد استفاده
• تست تالنز (Tollen’s Test): تعریف، اصول، روش، نتایج و موارد استفاده
• تست ساکاگوچی (Sakaguchi Test): تعریف، اصول، روش، نتایج و موارد استفاده
• تست بیال (Bial): تعریف، اصول، روش، نتیجه و موارد استفاده

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا