تست دئوکسی ریبونوکلئاز (DNase)

مقدمه‌ای بر تست دئوکسی ریبونوکلئاز

دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA) یک پلیمر بزرگ از نوکلئوتیدها است که برای ورود به غشای سلولی بسیار بزرگ است. به منظور استفاده از DNA خارجی، سلول‌های باکتری اگزوآنزیم‌هایی (DNases) را در خارج از سلول ترشح می‌کنند که DNA را به نوکلئوتید هیدرولیز می‌کند.

سپس نوکلئوتیدها می‌توانند از طریق پروتئین‌های ناقل در غشای سلولی حرکت کنند و مورد استفاده قرار گیرند. سلول می‌تواند از نوکلئوتیدها برای ساخت اسیدهای نوکلئیک و استفاده به عنوان منبع نیتروژن، فسفات و کربن استفاده کند.

DNaseهای خارج سلولی در زیرمجموعه نسبتاً کوچکی از پروکاریوت‌ها، از جمله تعدادی از پاتوژن‌های انسانی قرار گرفته‌اند. هیدرولیز DNA با رشد یک ارگانیسم بر روی پلیت DNase Test Agar (تأمین مواد مغذی و DNA)و سپس بررسی پلیت برای هیدرولیز آزمایش می‌شود.

تست هیدرولیز DNA یا دئوکسی ریبونوکلئاز (DNase)  برای تعیین توانایی یک موجود زنده در هیدرولیز DNA و استفاده از آن به عنوان منبع کربن و انرژی برای رشد استفاده می‌شود. هم چنین به شناسایی فعالیت دئوکسی ریبونوکلئاز باکتری‌ها و قارچ‌ها و به ویژه برای شناسایی استافیلوکوک‌های بیماری‌زا کمک می‌کند.

هدف تست DNase

برای تمایز ارگانیسم‌ها بر اساس تولید دئوکسی ریبونوکلئاز.

اساس تست دئوکسی ریبونوکلئاز

این تست برای تعیین توانایی یک موجود زنده در هیدرولیز DNA استفاده می‌شود.  DNase agar ، یک محیط متمایز است که توانایی یک موجود زنده را برای تولید یک آنزیم خارجی به نام دئوکسی ریبونوکلئاز آزمایش می‌کند. DNase ها، اندونوکلئازهای خارج سلولی هستند که DNA را می‌شکافند و نوکلئوتید و فسفات  آزاد می‌کنند.  DNase آگار حاوی مواد مغذی برای باکتری‌ها، DNA و بیشتر متیل گرین به عنوان یک شاخص است. متیل گرین کاتیونی است که به DNA با بار منفی متصل می‌شود.

دئوکسی ریبونوکلئاز به ارگانیسم‌هایی که آن را تولید می‌کنند اجازه می‌دهد تا DNA را به قطعات کوچک‌تر تجزیه کنند. هنگامی که DNA تجزیه می‌شود، دیگر به متیل گرین متصل نمی‌شود و یک هاله شفاف در اطراف مناطقی که ارگانیسم تولید کننده DNase رشد کرده است ظاهر می‌شود.

در DNase  آگار بدون نشانگر، هیدرولیز DNA با پاک‌سازی آگار پس از افزودن HCL مشاهده می‌شود (الیگونوکلئوتیدها در اسید حل می‌شوند؛ اما نمک‌های DNA نامحلول هستند). اسید، DNA هیدرولیز نشده را رسوب می‌دهد و محیط را مات می‌کند؛ بنابراین، کلنی‌های تولید کننده DNase، DNA را هیدرولیز می‌کنند و ناحیه‌ای شفاف در اطراف ناحیه رشد ایجاد می‌کنند.

محیط کشت مورد استفاده:

DNase Media:

• هضم پانکراتیک کازئین (۱۰ گرم)
• عصاره مخمر (۱۰ گرم)
• اسید دئوکسی ریبونوکلئیک (۲ گرم)
• NaCl (5 گرم)
• آگار (۱۵ گرم)
• متیل گرین (۰٫۵ گرم)
• pH 7.5

روش تست DNase

1. با استفاده از یک لوپ استریل، DNase آگار را با ارگانیسم مورد آزمایش تلقیح کنید.
2. پلیت را در دمای ۳۵-۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت انکوبه کنید.
3. پس از انکوباسیون، تغییر رنگ در DNase را با متیل گرین مشاهده می‌کنید.

در DNase آگار بدون شناساگر:

4. سطح آگار را با محلول HCL 1N پر کنید. اسید اضافی را از بین ببرید.
5. اجازه دهید معرف جذب صفحه شود.
6. در عرض ۵ دقیقه منطقه شفاف اطراف کلنی را مشاهده می‌کنید.

نتایج مورد انتظار تست دئوکسی ریبونوکلئاز

مثبت: محیط اطراف ارگانیسم مورد آزمایش بی‌رنگ است.

منفی: اگر تخریب DNA اتفاق نیفتد، محیط سبز باقی می‌ماند.

کاربردهای تست DNase

• برای تعیین توانایی یک موجود زنده در هیدرولیز اسید دئوکسی ریبونوکلئیک استفاده می‌شود.
• برای افتراق استافیلوکوکوس اورئوس که آنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز را از سایر استافیلوکوک‌هایی که DNase تولید نمی‌کنند استفاده می‌شود.
• به ویژه در صورتی مفید است که پلاسما برای انجام آزمایش کواگولاز در دسترس نباشد یا تفسیر نتیجه آزمایش کواگولاز دشوار باشد.
• همچنین برای تشخیص Serratia(+)از Enterobacter sp .
• تشخیص (+) Moraxella catarrhalis از Neisseria.

محدودیت‌های تست دئوکسی ریبونوکلئاز

• آگار باید با سوسپانسیون یک محیط کشت براث (۴ ساعته) یا یک کلنی ۱۸ تا ۲۴ ساعته در ۱ الی ۲ میلی لیتر سالین تلقیح شود.
• برخی از سویه‌های MRSA نتیجه مثبت نمی‌دهند و برخی از سویه‌های استافیلوکوک کواگولاز منفی مانند استافیلوکوکوس کاپیتیس، واکنش مثبت ضعیفی نشان می‌دهند.
• برای موراکسلا و کوکسی‌های گرم مثبت با تست TBO، تلقیح کم می‌تواند منجر به آزمایش منفی کاذب شود، زیرا این موجودات ممکن است به خوبی در محیط رشد نکنند.
• HCl 1N برای استافیلوکوک‌ها نقش باکتری‌کشی دارد. پس از اعمال HCl، آزمایش باید در عرض ۵ دقیقه خوانده شود و نمی‌توان آن را با انکوباسیون مجدد ادامه داد.

مطالعه بیشتر:

تست هیدرولیز نشاسته (Starch Hydrolysis Test): اصول، روش، موارد استفاده و تفسیر

تست موتیلیتی (Motility Test): اصول، رویه، کاربردها و تفسیر

منبع

مترجم: مریم محجوب