ترنسکریپتومیکس: تعریف، انواع، تکنیک‌ها، کاربردها

فهرست مطالب نمایش

ترنسکریپتومیکس چیست؟

مطالعه ترنسکریپتوم، شاخه‌ای از علم است که به مطالعه رونوشت ژنوم، که به مجموعه رونوشت‌های RNA در سلول خاصی از یک ارگانیسم اطلاق می‌شود میپردازد.

ترنسکریپتومیکس(Transcriptomics) شامل مطالعه‌ی هر چیزی که مربوط به RNA شامل توالی، ساختار، عملکرد، جایگاه، رونویسی، ترجمه، سطوح بیان و تخریب می‌باشد. روش‌های با توان بالا، نظیر آنالیز میکرواری و تعیین توالی RNA، برای مطالعه‌ی این رونوشت‌های RNA استفاده می‌شوند.

اهمیت ترنسکریپتومیکس به مطالعه همه‌ی رونوشت‌های mRNA در سلول برمی‌گردد که نشان‌دهنده ژن‌هایی است که در یک زمان خاص در سلول بیان می‌شوند. ترنسکریپتومیکس با مطالعه رونوشت‌های RNA، اطلاعاتی را درباره چگونگی بیان اطلاعات ژنتیکی، تولید پروتئین‌ها و عملکرد سلول‌ها در اختیار قرار می‌دهد و این دلیل اهمیت ترنسکریپتومیکس در فهم مکانیسم هایی است که طی آن اطلاعات ژنتیکی به عملکردهای سلولی می‌انجامند.

رشته ترنسکریپتومیکس همراه با دیگر شاخه‌های omics شامل ژنومیکس، پروتئومیکس و متابولومیکس توسعه یافته و به بخش مهمی از علوم زیستی مدرن تبدیل شده است. تکنولوژی‌های جدید ترنسکریپتومیکس، مطالعه‌ی RNA و عملکرد آن در روندهای زیستی مختلف را ساده‌تر نموده است.

مسیر توسعه ترنسکریپتومیکس در طول زمان

قبل از شکل‌گیری ترنسکریپتومیکس، مطالعه تک RNAها با روش و متدهای طاقت‌فرسایی نظیر نوردرن بلات (Northern blot) و توالی‌یابی سنگر انجام می‌شد. اگرچه این تکنیک‌ها در دهه 1990 بسیار فراگیر بودند، اما تکنیک‌های زمان‌بری بوده و فقط قادر به مطالعه‌ی بخش کوچکی از ترنسکریپتوم بودند.
واژه “transcriptome”، برای اولین بار در دهه 1990 استفاده و تلاش‌های ابتدایی برای مطالعه همه‌ی رونوشت‌ها در 1991 با انتشار بخشی از ترنسکریپتوم مغز انسان آغاز شد.
سال‌های ابتدایی دهه‌ی 1990 شاهد پیشرفت‌هایی در تعیین توالی رونوشت ESTها (Expressed Sequence Tag) با استفاده از توالی‌یابی سنگر بود.
در اواسط دهه 1990، توسعه‌ی تکنیک‌هایی نظیر آنالیز سریالی بیان ژن (SAGE) و میکرواری امکان مطالعه‌ی هم‌زمان هزاران رونوشت باهم را فراهم کرد.
توالی‌یابی RNA که در میانه دهه‌ی 2000 شکل گرفته بود، در ادامه با ایجاد امکان توالی‌یابی کل رونوشت‌ها با توان بالا گسترش یافت. سامانه‌های توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) نظیر Illumina، مطالعه‌ی ترنسکریپتوم را متحول کردند.
چنین پیشرفت‌هایی امکان مطالعه ترنسکریپتوم‌ بافت‌ها و بیماری‌های مختلف و حتی تک سلول را فراهم نموده و به درک ما از فرآیندهای سلولی و تنظیم ژنی کمک زیادی کردند.

انواع ترنسکریپتومیکس

انواع مختلفی از ترنسکریپتومیکس وجود دارند که متدهای اصلی شامل:

مطالعه انبوه ترنسکریپتوم (bulk transcriptomics)

در مطالعه انبوه ترنسکریپتوم، بیان ژن‌ها را در انبوهی از نمونه‌ها شامل هزاران سلول مطالعه و پروفایلی از بیان مجموعه ژن‌های یک جمعیت از سلول‌ها بررسی می‌کنند. این روش ما را در فهم الگوهای بیان ژن در گروه‌های سلولی بزرگ یاری می‌کند.
با این روش هم‌چنین می‌توان بیان هزاران ژن را به‌طور هم‌زمان و به‌صورت کمی بررسی کرد. با این حال محدودیت‌هایی نظیر عدم امکان مطالعه تنوع سلولی و شناسایی انواع نادر سلول‌ها در این روش وجود دارد.
اگرچه مطالعه‌ی انبوه ترنسکریپتوم چندین روش را در بر میگیرد، توالی‌یابی RNA همواره به عنوان نخستین روش مطالعه‌ی انبوه ترنسکریپتوم در اولویت قرار دارد.

مطالعه‌ی ترنسکریپتوم در تک سلول (Single-Cell Transcriptomics)

ترنسکریپتومیکس تک سلول برای مطالعه‌ی بیان ژن در سلول‌های منفرد مورد استفاده قرار می‌گیرد.
در مقابل ترنسکریپتومیکس انبوه، که بیان ژن را در انبوهی از نمونه‌ها بررسی می‌کند، ترنسکریپتومیکس تک سلول بیان ژن را در سطح تک سلول مورد بررسی قرار داده و به این ترتیب در مطالعه تنوع سلولی بسیار کارآمد می‌باشد.
ارگانیسم‌های چند سلولی انواع مختلفی از سلول‌هارا در بر می‌گیرند که هر یک پروفایل ترنسکریپتوم منحصر به خود را دارند. بنابراین توانایی مطالعه ژن‌ها در سطح بیان در سلول‌های منفرد جهت فهم تفاوت انواع سلول‌ها و روندهای بیولوژیک بسیار حائز اهمیت است.
مطالعه‌ی ترنسکریپتوم تک سلول، برای مطالعه تنوع سلولی و جمعیت‌های سلولی نادر که ممکن است در ترنسکریپتومیکس انبوه نادیده گرفته شده باشند استفاده می‌شود. این روش همچنین امکان ردیابی انواع سلولی جدید را نیز فراهم می‌کند.

ترنسکریپتومیکس ساختاری (Spatial Transcriptomics)

ترنسکریپتومیکس ساختاری بیان ژن‌ها را در یک نمونه با در نظر داشتن جایگاه فضایی آن بررسی می‌کند. مطالعه پراکندگی فضایی ژنها همراه با بیان آنها در فهم عملکرد و جای‌گیری آن‌ها حائز اهمیت می‌باشد.

از آن‌جا که ترنسکریپتومیکس انبوه و ترنسکریپتومیکس تک سلول ساختارهای سلولی را جهت مطالعه بیان ژنها تخریب می‌کنند، اطلاعاتی در مورد جایگاه فضایی ژن‌ها ارائه نمی‌کنند.
تکنولوژی‌های ترنسکریپتومیکس فضایی با حفظ ساختارهای سلولی در حین مطالعه، اطلاعات مهمی در رابطه با سیستم‌ها، تبادلات و عملکردهای سلولی در اختیار قرار می‌دهند.
ترنسکریپتومیکس فضایی را می‌توان به دو بخش شامل مطالعه بر پایه تصویر و بر پایه توالی تقسیم‌بندی نمود که در هر دو روش مطالعه‌ی ترنسکریپتوم با حفظ اطلاعات فضایی مربوط به آن انجام می‌شود.

متاترنسکریپتومیکس (Meta Transcriptomics)

متاترنسکریپتومیکس رونوشت‌های RNA و و بیان ژن را در کل یک جمعیت از ارگانیسم‌ها شامل میکروارگانیسم‌ها، گیاهان، جانوان و سایر یوکاریوت‌ها مطالعه می‌کند.
تمرکز متاترنسکریپتومیکس اولا روی مطالعه‌ی جمعیت‌های میکروبی می‌باشد. اگرچه که این مطالعه به میکروب‌ها محدود نبوده و سایر ارگانیسم‌ها را نیز در بر می‌گیرد.
این روش برای مطالعه عملکرد و تبادلات ارگانیسم‌ها با محیط طبیعی آن‌ها کارآیی بالایی دارد.
متاترنسکریپتومیکس عمدتا در مطالعات محیطی اکوسیستم‌های پیچیده نظیر میکروبیوم روده، خاک و نمونه‌های آب استفاده می‌شود.

متدهایی که در ترنسکریپتومیکس استفاده می‌شوند

متدهای مختلفی برای آنالیز ترنسکریپتوم ابداع شده است که پرکاربردترین آن‌ها عبارتند از:

توالی یابی EST یا Expressed Sequence Tag

EST ها توالی‌های نوکلئوتیدی کوتاه هستند که از یک تک RNA منشا می‌گیرند.
پردازش توالی‌های EST با رونوشت‌برداری معکوس RNA و تبدیل آن به DNA مکمل (cDNA) آغاز شده و با توالی‌یابی cDNA ادامه می‌یابد.
تا قبل از ابداع روش‌های با توان بالا، برای تعیین سکانس ESTها از توالی یابی سنگر استفاده می‌شد.
در سال‌های اخیر، روش‌های با توان بالا و حجم زیاد دیتای خروجی از این روش‌ها، RNA-Seq را متد غالب و جایگزین روش‌های مرسوم توالی‌یابی EST تبدیل کرده است.

آنالیز سریالی بیان ژن SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

SAGE اولین روش استفاده شده در تعییت توالی کل ترنسکریپتوم بود.
SAGE تکنیکی است که با ایجاد تگ‌های کوتاه mRNA، به بررسی کمی رونوشت‌های حاضر در نمونه‌های زیستی می‌پردازد.
اصل کلیدی SAGE، تبدیل mRNA به تگ‌هایی با توالی کوتاه و منحصر به فردمی‌باشد که با یک رونوشت خاص برهم‌کنش دارند. در ادامه این توالی‌ها جمع‌آوری و تعین توالی می‌شوند تا میزان بیان ژن برآورد شود.
مراحل SAGE با استخراج RNA از نمونه و تبدیل آن به cDNA با استفاده از آنزیم رونوشت بردار معکوس آغاز می‌شود. سپس با تیمار آنزیم محدودکننده روی cDNA، قطعات کوتاهی حاصل می‌شود که در ادامه به اداپتورهای الیگونوکلئوتیدی پیوسته و تگ‌های دوتایی معروف به ditag را بوجود می‌آورند. از تجمع ditagها یک زنجیره بلند حاصل می‌شود که درون یک وکتور کلون و تکثیر شده و سپس توالی‌یابی می‌شود. داده حاصل از توالی‌یابی برای شناسایی و کمی سازی رونوشت‌های اصلی mRNA مورد استفاده قرار می‌گیرند.
SAGE آنالیز کمی ترنسکریپتوم را ارائه کرده و در کشف ژن‌های جدید کارآیی بالایی دارد. اگرچه محدودیت‌هایی شامل دشواری شناسایی ژن‌های ناشناخته به دلیل طول کوتاه تگ‌ها، مشکلات اختصاصیت حاصل از همپوشانی توالی‌ها و ناسازگاری‌های بالقوه با برخی آنزیم‌های برشی نیز در این روش وجود دارد.

ریزآرایه (Microarrays)

یک ریزآرایه شامل الیگومرهای نوکلئوتیدی کوتاه معروف به DNA probe ها است که روی یک سطح جامد مشابه یک اسلاید شیشه‌ای فیکس می‌شوند و بیان ژن‌ها را بر اساس هیبریداسیون با قطعه هدف کمی سازی می‌کند.
در ابتدا RNA از سلول هدف استخراج شده و با عملکرد رونوشت بردار معکوس به cDNA تبدیل و با رنگ فلوئورسنت نشانه گذاری می‌شوند. پس از شستشو، اسلاید (array) با لیزر اسکن می‌شود. پروب‌هایی که با cDNA هیبرید شده بودند نور آزاد می‌کنند. شدت این نور برای محاسبه‌ی سطح بیان ژن تفسیر می‌شود.

علیرغم کارآیی این روش در مطالعه‌ی بیان ژن و ترنسکریپتوم، نتایج حاصل از میکرواری می‌توانند اختلافات فاحشی را در نتیجه شرایط آزمایشگاهی متفاوت، اسکن لیزر و خوانش فلوئورسنت متفاوت نشان دهند. بنابراین آنالیز بیان mRNA بر پایه ریزآرایه باید به عنوان یک مرحله اولیه در مطالعات انجام شود و در ادامه روی ژن‌های کاندید شده با این روش مطالعات تکمیلی با استفاده از تکنیک‌هایی نظیر RT-PCR صورت گیرد.

آنالیز ریزآرایه ها بطور قابل توجهی ارزان‌تر از توالی‌یابی RNA می‌باشد و هم‌چنین مدیریت داده‌های حاصل از ریزآرایه‌ها به دلیل حجم کمتر آن راحت‌تر است. اگرچه این تکنیک برای آنالیز ژن‌هایی با سطوح بیان بسیار پایین و هم‌چنین رونوشت‌های ناشناخته کارآیی پایینی دارد.

توالی‌یابی RNA

توالی‌یابی RNA ترکیبی از توالی‌یابی با توان بالا با آنالیزهای کامپیوتری جهت کمیت‌سنجی رونوشت‌های RNA می‌باشد. این تکنولوژی جدید بر پایه پلتفرم‌های توالی‌یابی نسل بعدی میباشد که عمدتا بصورت اتوماتیک انجام می‌شوند.

توالی‌یابی RNA امکان آنالیز همزمان هزاران مولکول RNA متفاوت را در یک خوانش فراهم می‌کند و بر خلاف روش‌های کلاسیک توالی‌یابی نظیر Sanger بسیار پرتوان هستند.
پروسه‌ی توالی‌یابی RNA با استخراج RNA و تبدیل آن به cDNA پایدار آغاز شده و در ادامه قطعات cDNA با استفاده از روش‌های توالی‌یابی با توان بالا تعیین توالی می‌شوند. داده‌های خام حاصل از توالی‌یابی برای ایجاد یک جدول شمارش مورد استفاده قرار می‌گیرند و با استفاده از ابزارهای آنلاین پردازش داده، کمیت بیان ژن‌ها را تعیین می‌کنند.
توالی‌یابی RNA قادر به کمی سازی گستره‌ی وسیعی از رونوشت می‌باشد اما به دلیل هزینه‌ی بسیار بالای آن نسبت به آنالیز ریزآرایه، در مطالعات با مقیاس بالا کاربرد محدودتری دارند.

کاربردهای مطالعه‌ی ترنسکریپتوم

ترنسکریپتومیکس در ردیابی و تشخیص بیماری کاربردهای گسترده‌ای دارد. روش‌های توالی‌یابی RNA به شناسایی عوامل تنظیمی نظیر جایگاه‌های آغاز ترجمه کمک می‌کنند که در بیماری‌های انسانی اهمیت زیادی دارند.
ترنسکریپتومیکس در فهم مکانیسم‌های مولکولی بیماری‌های مختلف کارایی دارد و به درک عوامل درمانی بالقوه کمک می‌کند.
ترنسکریپتومیکس برای مطالعه‌ی پاسخ‌های فردی به داروهای خاص در فارماکوژنومیکس و پزشکی شخصی‌سازی شده مورد استفاده قرار می‌گیرد.
هم‌چنین ترنسکریپتومیکس در فهم تبادلات میزبان-پاتوژن و مطالعه‌ی پاسخ‌های ایمنی کارآیی بالایی دارد.
مطالعات ترنسکریپتومیکس هم‌چنین در زیست‌شناسی تکوینی برای مطالعه‌ی بیان ژن‎ها در طی مراحل مختلف نمو مورد استفاده قرار می‌گیرد.
مطالعه‌ی ترنسکریپتوم هم‌چنین برای مطالعه RNA های غیر کد کننده که نقش قابل توجهی در پروسه‌های سلولی مختلف ایفا می‌کنند استفاده می‌شود.

همچنین بخوانید: