مقدمه‌ای بر تجزیه و تحلیل چرخه سلولی با استفاده از فلوسایتومتری
در طول چهار دهه گذشته، فلوسایتومتری بهبود یافته است تا امکان تجزیه و تحلیل بهتر چرخه سلولی را در شرایط مختلف فیزیولوژیکی فراهم کند. فلوسایتومتری بر روی اهداف مختلف مانند DNA سلول به منظور ردیابی پیشرفت چرخه سلولی تمرکز می‌کند.
چرخه سلولی
تقسیم سلولی با یک سری نقاط چک و بررسی به نام چرخه سلولی اتفاق می‌افتد. این چرخه دارای چهار مرحله اصلی به نام‌های زیر است:
- فاز (G1)
- سنتز (S)
- فاز (G2)
- فاز میتوزی (M)
مراحل مختلف چرخه سلولی همگی نقش‌های متمایزی دارند. در G1، سلول در حال آماده شدن برای سنتز DNA است. سنتز DNA در مرحله S اتفاق می‌افتد، که منجر به ایجاد سلول‌هایی می‌شود که دارای سطح بالایی از DNA هستند. پس از این، سلول برای میتوز آماده می‌شود و وارد میتوز می‌شود که طی آن سلول به دو سلول دختر جدا تقسیم می‌شود.
پیشرفت در چرخه سلولی توسط کینازهای وابسته به سایکلین (CDKs) و کمپلکس‌های سایکلین مدیریت می‌شود. CDK ها پروتئین کینازهایی هستند که در قسمت‌های خاصی در چرخه سلولی فعال می شوند. بدون فعال سازی CDK، از میتوز جلوگیری می‌شود. تنظیم چرخه سلولی تا حد زیادی با فسفوریلاسیون CDK ها و سایکلین‌ها انجام می‌شود.
فلوسایتومتری
تجزیه و تحلیل چرخه سلولی یکی از رایج ترین کاربردهای فلوسایتومتری است.به همین خاطر تکنیک‌های فلوسایتومتری گسترش و توسعه یافته‌اند. همه این تکنیک‌ها بر کمی کردن اجزای درون سلولی، معمولاً DNA، و همچنین مولکول‌های متابولیک مرتبط با چرخه سلولی، مانند CDKs و سایکلین‌ها تمرکز دارند.
برخی از تکنیک‌ها تک متغیره هستند، به این معنی که فقط بر روی اندازه گیری محتوای DNA تمرکز می‌کنند. مقدمه این امر با آماده سازی سلول ها با رنگ فلورسنت است که به سلول‌ها یا هسته‌های منفرد نفوذ پذیر اضافه می‌شود. یک رنگ رایج که اسید نوکلئیک را هدف قرار می‌دهد پروپیدیوم یدیدئ(PI) است. این رنگ به DNA متصل می‌شود و در طول فلوسایتومتری، DNA یک سیگنال فلورسنت منتشر می‌کند.
بنابراین، کل فلورسانس ساطع شده از سلول بسته به مقدار DNA موجود متفاوت خواهد بود. به همین دلیل، فازهای G2 و M اغلب نمی‌توانند از یکدیگر متمایز شوند، زیرا محتوای DNA مشابهی دارند. فلوسایتومتری گاهی اوقات می‌تواند محتوای DNA سلولی دو سلول را به عنوان یک سلول شناسایی کند.
به این پدیده پیداکردن دوتایی می‌گویند که در آن دو سلول با محتوای DNA معمول سلول‌های G1 به عنوان یک سلول منفرد با محتوای DNA معمول فاز G2/M اشتباه گرفته می‌شوند. برای تصحیح این موضوع، فلوسایتومترها را می‌توان به یک ماژول تشخیص دوگانه مجهز کرد. ماژول تفکیک دوگانه می‌تواند سلول های منفرد را بر اساس داده های پردازش شده با پالس انتخاب کند.
داده‌های پردازش شده با پالس از فلورسانس ساطع شده رنگ‌های DNA تهیه می‌شوند که علاوه بر اندازه‌گیری شدت، می‌تواند ناحیه پالس و عرض پالس نمونه‌ها را نشان دهد. ترسیم عرض در برابر ناحیه به ماژول اجازه می‌دهد تا دوتایی های G1 را از تک سلول‌های G2/M جدا کند.
تجزیه و تحلیل سایکلین‌ها و CDK ها در چرخه سلولی توسط فلوسایتومتری پیچیده تراز DNA است، زیرا سایکلین‌های مختلف در قسمت‌های مختلف فعال می‌شوند.
به عنوان مثال، سایکلین‌های A و B بیان بالایی در فاز S نشان می‌دهند. CDKI p16 بیان بالایی را در طول فاز G1 نشان می‌دهد، در حالی که CDKI p21 چنین نیست. این الگوی بیان می‌تواند در طول بیماری‌هایی مانند سرطان تغییر کند.
اندازه گیری تایم لپس و اسنپ شات
اندازه‌گیری‌ها را می‌توان به‌عنوان اندازه‌گیری سلولی Snapshot یا اندازه‌گیری با Time-laps انجام داد. یک اندازه گیری نقطه‌ای با در نظر گرفتن پارامتر تعداد و زمان می‌تواند درصد سلول ها را در فازهای G1، S و G2/M در یک نقطه نشان دهد. اندازه‌گیری‌های تایم لپس می‌توانند جمعیت سلول‌ها را در چرخه سلولی به صورت هماهنگ نشان دهند یا پیشرفت چرخه سلولی را در نقاط خاصی از چرخه سلولی ثبت کنند.
برخلاف اندازه‌گیری‌های تک نقطه‌ای بر حسب زمان، این اندازه‌گیری‌ها سینتیک پیشرفت سلول را در چرخه سلولی نشان می‌دهند. علاوه بر DNA، ممکن است اقدامات دیگری نیز لازم باشد. تشخیص سلول‌هایی که در فرآیند سنتز DNA هستند می‌تواند با استفاده از تکنیک‌های دو متغیره انجام شود، به این معنی که از DNA و نشانگر دیگری برای پیشرفت چرخه سلولی استفاده شود.
برخی روش‌ها از آنالوگ تیمیدین به نامbromo-2’-deoxyuridine (BrdU) -’5 استفاده می‌کنند. BrdU معمولاً برای اندازه‌گیری تکثیر سلولی در بافت‌های زنده استفاده می‌شود، به این معنی که می‌توان آن را برای اندازه‌گیری Snapshot یا اندازه‌گیری Time-laps استفاده کرد. اندازه‌گیری‌های تایم‌لپس این مزیت را دارند که می‌توانند سرعت پیشرفت را در چرخه سلولی نشان دهند تا مشخص کنند سلول‌ها در کدام مرحله هستند.
در فلوسایتومتری، BrdU را می‌توان با استفاده از رنگ‌های DNA یا با آنتی‌بادی‌های فلورسنت BrdU شناسایی کرد، که نشان دهنده ادغام BrdU به DNA سلول‌ها است.
همچنین بخوانید:
- فلوسایتومتری در آنالیز سلول‌های خون محیطی
- دوره مهارت آموزی فلوسایتومتری
- تشخیص آنیوپلوئیدی با فلوسایتومتری
- کاربردهای فلوسایتومتری در هماتولوژی
- ایمونوسیتوفلورسنت و آشنایی با فلوسایتومتری
- فیلترهای نوری در فلوسایتومتری و استفاده از آن
