بندینگ (G- banding)

مقدمه‌ای بر بندینگ (G- banding)

باند G،  یا باند Giemsa روشی است که در سیتوژنتیک برای تولید کاریوتایپ قابل مشاهده با رنگ آمیزی کروموزوم های متراکم استفاده می شود. از این تکنیک برای شناسایی بیماری های ژنتیکی از طریق عکاسی از کل کروموزوم ها استفاده می شود. کروموزوم های متافاز با تریپسین (برای هضم نسبی کروموزوم) تیمار می شوند و با رنگ گیمسا رنگ آمیزی می شوند.

مناطق هتروکروماتیک، که غنی از آدنین و تیمین هستند در باند G تاریک تر رنگ می گیرند. در مقابل، یوکروماتین که کم تراکم است (Euchromatin) – غنی از گوانین و سیتوزین است و از نظر رونویسی فعال تر  است – این مناطق به صورت نوارهای روشن تری در باند G ظاهر می شوند. الگوی باندها روی هر بازوی کروموزوم از سانترومر تا تلومر شماره گذاری می شوند.

این سیستم شماره گذاری امکان شناسایی و توصیف دقیق هر باند روی کروموزوم را فراهم می کند. تکنیک معکوس باند G، باند R است. باندینگ برای شناسایی ناهنجاری های کروموزومی مانند جابجایی کاربرد دارد زیرا الگوی منحصر به فردی از نوارهای روشن و تاریک برای هر کروموزوم وجود دارد.

بندینگ

نامگذاری کروموزوم‌های انسانی براساس نتایج حاصل از چندین کنگره‌ی بین المللی صورت گرفته است (Denver 1960، London 1963، Chicago1966، Paris 1971، Paris 1975، Stockholm 1977، Paris 1980، Memphis 1994، Vancouver 2004، Vancouver 2008، Seattle 2012، San Diego 2014).

1- نامگذاری و مورفولوژی کروموزوم ها

1-1. تکنیک‌های Non-banding

در یک کاریوگرام کروموزوم‌های اتوزوم از شماره‌ی 1 تا 22 بر اساس کاهش طول شماره گذاری شده‌اند( با این استثنا که کروموزوم 21 کوچیکتر از کروموزوم 22 است). کروموزوم‌های جنسی به صورت X و Y نامگذاری شده‌اند.

زمانی که کروموزوم‌ها براساس متدهایی که بند در آنها تشکیل نمیشود نامگذاری می‌شوند، در هفت گروه کاملا مجزا (A-G) بر اساس  کاهش طول و جایگاه سانترومر قرار می‌گیرند. در این روش حروف مشخص کننده گروه‌ها قبل از شماره‌ی کروموزومی قرار می‌گیرد )براساس توافق صورت گرفته درگنگره ی (London 1963 . در این شماره گذاری همه کروموزوم‌های گروه‌های D و G دارای satellite در انتهای بازوی کوتاه خود نیستند.

از پارامترهای مقابل جهت نامگذاری کروموزوم‌ها در تکنیک‌های Non-banding استفاده می شود:

1) طول هر کروموزوم؛ که براساس طول کلی کروموزهای نرمال است هاپلوئیدی بیان می‌شود.

2) نسبت طول بازوی کروموزومی؛ که براساس طول بازوی بلند نسبت به طول بازوی کوتاه کروموزوم بیان می‌شود.

3) جایگاه سانترومر؛ که براساس نسبت طول بازوی کوتاه کروموزوم به طول کلی کروموزوم بیان می‌شود.

گروه‌ها:

Group A (1-3): کروموزوم‌های متاسانتریک (سانترومر در مرکز کروموزوم قرار گرفته بنابراین طول بازوهای بلند و کوتاه تقریبا با هم برابر است) بزرگ هستند که به واسطه‌ی طول بلند و جایگاه سانترومری مشخص از همدیگر به راحتی قابل تمایز هستند.

Metacentric chromosomes

Group B (4-5):  شامل کروموزوم‌های ساب متاسانتریک (سانترومر در نزدیکی مرکز کروموزوم قرار گرفته، بنابراین طول بازوهای کوتاه و بلند اندکی با هم متفاوت است) بزرگ هستند.

Sub metacentric chromosomes

Group C (6-12, X): کروموزوم‌های متاسانتریک و ساب متاسانتریک متوسط در این گروه قرار می‌گیرند. کرومووزم X بزرگترین کروموزوم این گروه است.

Group D (13-15): کروموزوم‌های آکروسانتریک (کروموزوم هایی که سانترومر در نزیکی انتهای کروموزوم قرار گرفته) کوچک همراه با satellite در انتهای کروموزوم در این دسته قرار می‌گیرند.

Acrocentric chromosomes

Group E (16-18): کروموزوم‌ها متاسانتریک و ساب متاسانتریک نسبتا کوچک در این گروه قرار می‌گیرند.

Group F (19-20): کروموزوم‌های متاسانتریک کوچک در این دسته بندی قرار می‌گیرند.

Group G (21-22, Y): کروموزوم‌های آکروسانتریک کوچک همراه با satellite در این دسته قرار می‌گیرند. کروموزوم Y در این دسته فاقد satellite است.

2-1. تکنیک بندینگ

در تکنیک‌های زیادی نشان داده شده است که تولید الگوهای باندبندی و نوارهای رنگی در مرحله ی متافاز میتوز را میتوان جهت نام گذاری کروموزوم‌ها بکار برد.

یک باند (band) به عنوان بخشی از کروموزوم تعریف می‌شود که به صورت کاملا واضح از بخش‌های کناری آن در کروموزم قابل تمایز است. این عمل به وسیله‌ی ایجاد نقاط تاریک و روشن در تکنیک‌های مختلف بندینگ امکان پذیر است. باندهایی که در یک روش بندینگ به صورت تاریک ظاهر می‌شوند ممکن است در تکنیک دیگر بندینگ به صورت روشن ظاهر شوند یعنی روشن یا تاریک بودن یک ناحیه به نوع تکنیک بندینگ وابسته است. در تکنیک‌های بندینگ کروموزوم بصورت نقاط تاریک و روشنی که به صورت پیوسته پشت سر هم قرار گرفته‌اند مشخص می‌شوند بنابراین هیچ ناحیه‌ی بدون رنگی در این تکنیک‌ها وجود ندارد.

اولین متدی که جهت نمایش باندها در طول کروموزوم منتشر شد، روشی بود که از quinacrine mustard یا quinacrine dihydrochloride جهت ایجاد الگوهای باندی فلورسنتی استفاده میکرد. این روش را رنگ‌آمیزی کیو(Q-Staining) نامیدند و به نتایج حاصل از آن باندهای کیو (Q-Bnding) میگفتند(fig. 1). در این روش شماره‌هایی که به کروموزوم‌ها داده میشود براساس شماره‌گذاری است که caspersson  و همکارانش در سال 1972 براساس مشاهده‌های خود از الگوهای باندینگ Q دادند.

در این نوع رنگ آمیزی  نواحی AT rich که عموما دارای تعداد کمی ژن هستند و به نواحی هتروکروماتین معروف هستند، به صورت باند‌های تیره رنگ دیده می‌شوند و نواحی GC rich که عموما غنی از ژن هستند و به نواحی یوکروماتین معروف هستند، به صورت نوارهای روشن دیده می‌شوند. بنابراین نواحی غنی از ژن که غالبا غنی از GC هستند بصورت نوارهای روشن در این روش دیده می‌شوند.

با آنالیز این باندها نه تنها کروموزوم‌ها از هم قابل تشخیص هستند، بلکه می‌توان ناهنجاری‌های ساختاری کروموزوم‌ها را نیز تشخیص داد. یکی از مهم ترین ایرادات روش Q-Banding این است که نور فلورسنت خیلی زود از بین می‌رود بنابراین باید خیلی سریع از باندها عکس برداری شود.

تکینک دیگری که به ما الگوهای باندی مشابهی می‌دهد تکنیک G-Banding است. در این روش جهت ایجاد باندهای روشن و تاریک از رنگ گیمسا (Giemsa) همراه با ترکیبات رنگی دیگر استفاده می‌شود (Fig. 2)

گیمسا یک ترکیب رنگی از methylene blue-eosin  و  methylene blue است. دراین تکنیک نیز نواحی که از نظر رونویس فعال هستند (غنی از GC) به صورت نوارهای روشن و نواحی فقیر از ژن و هتروکروماتین (غنی از (AT به صورت نوارهای تیره رنگ دیده می‌شوند.تکنیک‌های بندینگ دیگری وجود دارد که الگوی باندها در این تکنیک‌ها عکس الگوی رنگی در G-staining است که اصلاحا به آنها reverse staining methods می‌گویند و به باند‌های حاصل از این تکنیک‌ها R-bands می‌گویند.

در روش R-banding  همانطور که گفته شد الگوی باندها برخلاف الگوهای رنگی در G-banding است، بنابراین نواحی غنی از ژن (GC rich) در این روش به رنگ تیره در می‌آیند و نواحی فقیر از ژن (AT rich) به صورت نوارهای روشن دیده می‌شوند(Fig. 3).

تکنیک‌های بندینگ به دو گروه اصلی تقسیم می‌شوند: (1)آنهایی که کل کروموزوم را رنگ‌آمیزی می‌کنند و هر الگوی باندی نشان دهنده یک کروموزوم است مثل G-, Q- and R-banding. (2) آنهایی که ساختارهای کروموزومی خاصی را رنگ‌آمیزی می‌کنند. این‌ها شامل متدهایی هستند که باعث رنگ‌آمیزی هتروکروماتین‌های دائمی (C-bands) (Fig. 4)، نواحی تلومری (T-bands) و نواحی سازمان دهنده هستکی (NOR) می‌شوند.

با الگوهایی که از روش C-banding به دست می‌آید نمیتوان همه کروموزوم‌ها را شناسایی کرد اما از آنها جهت شناسایی کروموزوم‌های خاصی می‌توان استفاده کرد. C-band های حاصل از کروموزوم‌های 1, 9, 16  و Y همگی از لحاظ مورفولوژی متغییر هستند. بازوی کوتاه کروموزوم‌های آکروسانتریک تنوع زیادی در سایز و شدت رنگ پذیری  در متدهای Q-, G-, R-, C- and Nor-banding نشان می‌دهند.

شناسایی و گروه بندی کروموزوم ها بر اساس رنگ آمیزی ساده، امری دشوار است زیرا رنگ آمیزی یکنواخت ساختار کروموزوم ها، تمایز بین کروموزوم های مختلف را دشوار می کند. بنابراین، تکنیک هایی مانند باند G ایجاد شده است که باعث می شود “باند ها” در کروموزوم ها ظاهر شوند. این نوارها از نظر ظاهری در کروموزوم های همولوگ یکسان هستند بنابراین شناسایی را آسان تر و دقیق تر می کند. هر چه کروموزوم های متراکم کمتر باشند، هنگام انجام تکنیک باند G نوارهای بیشتری ظاهر می شود. این به این معنی است که کروموزوم های مختلف در پروفاز نسبت به متافاز متمایز تر  هستند.

انواع دیگر باندینگ های سیتوژنیک عبارتند از: