بازدید از آزمایشگاه کشت سلول

بازدید از آزمایشگاه کشت سلول

آزمایشگاه های کشت سلول جانوری کمی متفاوت تر از آزمایشگاه های دیگر بوده و به دلیل حساسیت بالای سلول های جانوری، آزمایشگاه های کشت سلول عموما در سطوح بالاتر ایمنی قرار می گیرند. زمانی که سلول ها از یک بافت جانوری جدا می شوند، به دور از میزبان خود شرایط جدیدی برای رشد را تجربه خواهند کرد.

 به عنوان مثال اگر یک تک سلولی مانند باکتری را در نظر گرفت، می توان آن را به عنوان یک موجود زنده کامل در نظر گرفت. به طوری که هر سلول باکتری به تنهایی یک موجود کامل را تشکیل داده و تمامی وظایف سلولی بر عهده همان باکتری می باشد. اما زمانی که یک بخشی از بافت خاص از یک موجود زنده پرسلولی جدا شده و سلول های آن کشت داده می شوند، شرایط فرق می کند. چرا که در موجودات پرسلولی در اثر تکوین هر بافت و اندامی وظایفی خاصی را بر عهده گرفته و مجموعا با همکاری یکدیگر یک سیستم زنده را شکل می دهند.

به عنوان مثال سیستم خون رسانی در پستانداران وظیفه رساندن مواد غذایی، اکسیژن و تأمین ایمنی را بر عهده دارند. لذا زمانی که بخشی از بافت یک جاندار پرسلولی جدا می شود از حساسیت بالایی برخوردار بوده و برای کشت آن باید شرایطی شبیه به بدن میزبان فراهم نمود. فراهم آوری چنین شرایطی موجب می گردد کشت سلول های جانوری و مخصوصا پستانداران کمی دشوار به نظر آید.

در راستای همین مسئله، سیستم های اتاق کشت جدا از مجموعه آزمایشگاهی ساخته شده و در بخش ورودی واجد Clean Room می باشند. افراد قبل از ورود به اتاق کشت از اتاق تمیز (Clean Room) عبور کرده و پس از تعویض روپوش خود، همچنین استفاده از کلاه مخصوص و دستکش وارد اتاق کشت شده و مشغول به کار می شوند.

همچنین جهت جلوگیری از بوجود آمدن انواع آلودگی ها الکل کشی به کررات در اتاق کشت انجام می شود. اتاق کشت آزمایشگاه ژنیران براساس اصول تأیید شده جهانی اتاق های کشت، ساخته شده و تمام اصول ایمنی مربوطه در آن رعایت می گردد. کارآموزان دوره کشت سلول، در ابتدای دوره با سیستم اتاق کشت آزمایشگاه ژنیران آشنا شده و از ابزار و تجهیزات مورد استفاده بازدید می کنند.

همچنین ظروف مخصوص کشت سلول جانوری را مشاهده کرده و به بررسی سلول های از قبل کشت داده شده درون فلاسک های مخصوص کشت سلول زیر میکروسکوپ اینورت فلوئورسنت می پردازند.

آشنایی با انواع محیط های کشت، سرم ها، supplements و آنتی بیوتیک ها

آشنایی با انواع محیط های کشت :

در سیستم کشت سلول های جانوری، به دلیل کشت سلول های جدا شده از یک میزبان پرسلولی، به وجود آوردن شرایط یکسان با هومئوستازی میزبان بسیار حائز اهمیت می باشد. باید توجه داشت که در پستانداران سیستم گوارشی با هضم مواد غذایی کمپلکس، ترکیبات ساده قابل جذب برای سلول ها فراهم کرده و توسط سیستم گردش خون این ترکیبات را در سراسر بدن در معرض سلول ها قرار می دهد.

 محیط کشت کامل مخصوص سلول های جانوری عموماً از بخش های ثابتی تشکیل شده است. دو بخش عمده تشکیل دهنده یک محیط کشت کامل، محیط کشت پایه (Basal Media) و سرم می باشد. برخی اوقات برای رشد رده های سلولی خاص، مواد مغذی (Supplements) مخصوصی مورد نیاز است.

محیط کشت پایه (Basal Media) محیطی را فراهم می آورد تا سلول ها بتوانند درون آن محیط و در pH مناسب رشد کنند. انواع محیط های پایه نسبت به ترکیباتی که دربر می گیرند با هم تفاوت داشته و برای کشت هر رده سلولی انواع خاصی از آن به کار گرفته می شود. همچنین محیط کشت پایه جهت ثابت نگه داشتن pH شامل یک سیستم بافری بوده و همچنین معرفی رنگی فنول رد (Phenol Red) جهت نشان دادن تغییرات pH در آن وجود دارد.

سیستم بافری محیط کشت پایه جهت حفظ تعادل نیاز به حضور کربن دی اکسید کربن داشته و به کمک آن سیستم کربنات/بیکربنات را شکل می دهند. همانطور که مشخص است سلول ها به واسطه متابولیسم خود با تولید پروتون محیط را اسیدی کرده و تحت چنین شرایطی مولکول های بیکربنات حاصل گشته از سیستم بافری محیط کشت پایه و کربن دی اکسید، با پروتون ایجاد شده واکنش داده و اسید کربنیک بوجود می آورند. اسید کربنیک نیز به راحتی تجزیه شده و به مولکول های آب و دی اکسید کربن تبدیل می شود.

سرم ها نیز مخلوطی از انواع مواد غذایی مانند پروتئین ها، ویتامین ها و فاکتور های رشد می باشد. عموماً در کشت سلول های جانوری از سرم جنین گاوی (FBS) استفاده می شود. سرم جنین گاوی (FBS)نسبت به سایر سرم ها غنی تر بوده و فاکتور های رشد بیشتری را شامل می شود. البته از طرفی سرم جنین گاوی (FBS) ایمونوگلوبین های کمتری را در خود دارد.

سرم نیز به نوبه خود سیستم بافری محیط کشت پایه را تقویت نموده و از تغییرات pH جلوگیری می کند. مواد مغذی (Supplements) نیز در شرایط خاصی مورد استفاده قرار می گیرد. برخی اوقات رده های سلولی خاص جهت رشد علاوه بر ترکیبات و مواد غذایی موجود در محیط کشت پایه و سرم، نیاز به ترکیبات خاصی دارد که درون محیط کشت کامل وجود ندارد. در چنین مواردی بسته به ماده مغذی مورد نیاز، تهیه شده و به محیط کشت کامل اضافه می گردد.

باید توجه داشت که سیستم محافظتی در بدن پستانداران توسط سلول های ایمنی خون حاصل گشته و در کشت سلول های پستانداران دیگر سیستم ایمنی به جهت محافظت از سلول ها وجود ندارد! لذا علاوه بر بالابردن سطح ایمنی اتاق کشت، باید شرایط دیگری فراهم نمود تا احتمال آلودگی سلول ها توسط پروکاریوت ها و یوکاریوت های میکروسکوپی به حداقل برسد.

بدین جهت آنتی بیوتیک های مناسب به محیط کشت کامل اضافه می شود. البته باید توجه کرد آنتی بیوتیک خود به تنهایی در غلظت های بالا موجب کاهش رشد سلول های جانوری شود. لذا باید در تهیه محیط کشت کامل به همراه آنتی بیوتیک، به غلظت آن درون محیط کشت توجه ویژه نمود.

برای یادگیری کامل آشنایی با انواع محیط های کشت و همچنین تئوری و عملی کشت سلولی اینجا کلیک کنید.

Cryopreservation: An Overview of Principles and Cell-Specific Considerations

انجماد یا فریز: مروری بر اصول و ملاحظات خاص سلول

منشا تحقیقات ذخیره ­سازی بافت در دمای پایین به اواخر دهه 1800 برمی­گردد. بیش از نیم قرن بعد، مشخص شد که تنش اسمزی عامل اصلی مرگ سلولی در طول انجماد است. در نتیجه، افزودن عوامل انجمادی (CPAs یا cryoprotective agents) مانند دی­متیل­سولفوکسید (DMSO)، گلیسرول (GLY)، اتیلن­گلیکول(EG)، یا پروپیلن­گلیکول(PG) اگرچه برای سلول‌ها در غلظت‌های بالا سمی است، به عنوان یک مرحله ضروری برای محافظت در برابر مرگ سلولی در طول انجماد شناخته شد.

علاوه بر تنش اسمزی، سرعت سرد شدن و ذوب نیز تأثیر قابل توجهی بر بقای سلول در طول ذخیره سازی در دمای پایین دارد. به طور کلی، حفظ موفقیت آمیز سلول در دمای پایین شامل: افزودن یک CPA (معمولاً 10% تا 5% DMSO) به تنهایی یا در ترکیب با عوامل نفوذ کننده یا غیر نفوذکننده، نرخ کاهش دما (تقریباً 1 درجه سانتیگراد در دقیقه)، و ذخیره سازی در مایع نیتروژن یا فاز بخار مایع نیتروژن است. علاوه بر ملاحظات کلی، توصیه‌های اختصاصی برای سلول‌های کبدی، جزایر پانکراس، اسپرم، تخمک‌ها و سلول‌های بنیادی باید برای به حداکثر رساندن بازده رعایت شود.

برای مثال، کاهش دما سریع با نتایج انجماد بهتر برای تخمک‌ها، جزایر پانکراس و سلول‌های بنیادی جنینی همراه است در حالی که کاهش دما آهسته برای انجماد سلول‌های کبدی، سلول‌های بنیادی خونساز و سلول‌های بنیادی مزانشیمی توصیه می‌شود. با اجرای مراحل اضافی قبل از کرایو مانند: از قبل انکوبه کردن با گلوکز و آنتی اکسیدان­ها، کپسوله کردن آلژینات، و انتخاب سلول­ها در محدوده سنی و توانایی عملکردی بهینه، بازده را می­توان بیشتر کرد. در نهایت، سنجش زنده­مانی و عملکردی، مراحل حیاتی در تعیین کیفیت سلول‌ها پس از ذوب و بهبود کارایی روش‌های انجماد فعلی هستند.

منشا تحقیقات ذخیره­‌سازی بافت در دمای پایین به اواخر دهه 1800 برمی­گردد. از آن زمان، پیشرفت‌های متعددی در رابطه با حفظ انجماد انجام­شده­است و بهینه‌سازی پروتکل همچنان یک حوزه تحقیقاتی فعال است. انجماد اجازه می­دهد تا تعداد زیادی از سلول­ها و بافت­ها را که می­توان برای تحقیقات علمی و کاربردهای پزشکی از جمله پیوند سلول­های کبدی و جزایر پانکراس، انتقال خون، پیوند مغز استخوان، لقاح مصنوعی، و لقاح آزمایشگاهی مورد استفاده قرار داد را ذخیره‌­سازی کرد.

با این حال، برای موفقیت­آمیز بودن این روش‌های درمانی، مقادیر زیادی از نوع سلول مورد­نظر باید در حالت آماده‌باش نگه­ داشته ­شود و برای استفاده در صورت تقاضا در­دسترس باشد که از طریق فرآیند انجماد امکان‌پذیر می‌شود.

تاریخچه انجماد(Cryopreservation)

پس از کشف میکروسکوپ، اسپالانزانی(Spallanzani) در سال 1776 مشاهده کرد که اسپرم می­تواند تحرک خود را حتی در شرایط دمای سرد حفظ کند. تحقیقات در مورد اثرات انجماد بر بافت زنده ریشه در اواخر دهه 1800 داشت، زمانی که دانشمندان از این فناوری برای حفظ اسپرم و سلول­های خونی قرمز(RBCs) استفاده کردند.

در این مدت، تحقیقات نقاط ضعفی را در این فرآیند نشان داد که باعث نتایج متناقض و ناباروری مکرر ناشی از مرگ زودهنگام جنینی شد. در دهه 1950 زمانی که جیمز لاولاک (James Lovelock) کشف کرد که فرآیند انجماد با انجماد فوری مایع که مستقیماً به تشکیل کریستال‌های یخ در RBC کمک می‌کند، باعث ایجاد استرس اسمزی در سلول می‌شود، پیشرفتی رخ داد.

در سال 1963، مازور(Mazur) توانست این فرآیند را مشخص کندکه سرعت تغییر دما در یک محیط حاوی سلول، حرکت آب را در طول غشای سلولی و در نتیجه درجه انجماد درون سلولی را کنترل می‌کند. این با هم به بهبود درک کلی مکانیسم مرتبط با فرآیند محافظت در برابر سرما کمک کرد. در طول دهه 1980، تحقیقات پیرامون فرآیند انجماد نشان داد که سرعتی که در آن فرآیند انجماد و ذوب رخ می‌دهد، مهم‌ترین عامل در تعیین بقای سلول‌ها است.

نشان ­داده­ شد که افزایش­های کوچک و آهسته در هر دو فرآیند انجماد و ذوب از تشکیل سریع کریستال­های یخ جلوگیری می­کند که املاح متصل به غشاء و مرتبط با مرگ زودرس سلول را افزایش می­دهد. یکی­ دیگر از پیشرفت‌های اولیه در انجماد در اواخر دهه 1940 رخ داد، زمانی­که محققان دریافتند که استفاده از گلیسرول به عنوان یک محیط، بقای اسپرم را در دمای زیر انجماد (70- درجه سانتیگراد) افزایش می‌دهد.

گلیسرول به عنوان یک محیط، به طور موثری برای محافظت از سلول­ها در برابر تشکیل سریع کریستال یخ در طول فرآیند نگهداری عمل کرد. یک عامل دیگر محافظ سرمایی که در حال حاضر استفاده می­شود دی­متیل­سولفوکسید (DMSO) است که قبل از فرآیند انجماد به محیط سلولی اضافه می­شود.DMSO  هنگامی که به محیط سلولی، معمولاً در غلظت 2 مولار اضافه می­شود،

تخلخل غشای سلولی را افزایش می­دهد، که به آب اجازه می­دهد آزادانه­تر از طریق غشاء جریان یابد. علاوه بر این، مانند گلیسرول، DMSO نیز با افزایش غلظت املاح درون سلولی، به جلوگیری از تشکیل کریستال‌های آب کمک می‌کند و در نتیجه به انجماد آب در دماهای پایین کمک می­کند.

اصول انجماد

به منظور درک کامل نقش عوامل محافظت­کننده در برابر سرما (CPAs) ابتدا باید اثرات دماهای زیر صفر بر بافت سالم را درک ­کنیم. قرار­دادن سلول­ها در دمای کمتر از 0 درجه سانتیگراد بدون کمک محافظ انجمادها معمولاً کشنده است. از آنجایی که آب تقریباً 80 درصد از توده بافت را تشکیل می­دهد، انجماد آب، چه درون و چه خارج سلولی، بیشترین تأثیر را بر تغییرات مضر بیوشیمیایی و ساختاری دارد که تصور می­شود منجر به آسیب انجماد محافظت نشده شود. دو نظریه مستقل وجود دارد که تلاش می­کنند اثرات مضر انجماد را بر سلول‌ها توضیح دهند:

(1) کریستال‌های یخ به طور مکانیکی یکپارچگی غشاهای سلولی را مختل می‌کنند و بنابراین دستیابی به سلول‌های سالم از لحاظ ساختاری پس از ذوب­شدن یا دیفریز را غیرممکن می‌سازند.

 (2) افزایشی کشنده در غلظت املاح در فاز مایع باقیمانده رخ می­دهد زیرا بلورهای یخ در داخل سلول در طول کاهش دما تشکیل می­شوند. چه اثرات مکانیکی یا اسمزی انجماد غالب باشد، نتیجه نهایی یکسان است. کاهش دما و ذوب بدون محافظت سلول­ها فرآیندی ناسازگار با زندگی است. برای کاهش این اثرات، دو اقدام حفاظتی باید انجام شود: استفاده از یک محافظ برودتی، و انتخاب سرعت کاهش دما و ذوب مناسب.

عوامل نفوذ کننده (Permeating Agents)

تعدادی از عوامل نفوذ کننده (PAs) در حال حاضر وجود دارند مانند گلیسرول (اولین عامل کشف شده)، دی متیل سولفوکسید (DMSO) اتیلن گلیکول (EG) و پروپاندیول (پروپیلن گلیکول). توانایی هر یک از این ترکیبات برای محافظت از سلول در برابر اثرات مکانیکی و اسمزی انجماد به چندین ویژگی بستگی دارد. عوامل نفوذ کننده باید در دماهای پایین بسیار محلول در آب باشند، بتوانند به راحتی از غشاهای بیولوژیکی عبور کنند و در حالت ایده­آل، حداقل سمی باشند.

ساختار چهار عامل نفوذکننده رایج از 100 مورد که شناخته شده­اند در (شکل 1) نشان­ داده­ شده است. اندازه نسبتا کوچک آنها (معمولاً کمتر از 100 دالتون) و ماهیت تا حدی آمفیفیلیک آنها اجازه می­دهد تا به راحتی به غشای سلولی نفوذ کنند جایی که می­توانند اثرات خود را اعمال کنند. توانایی سازه­ها در پیوند هیدروژنی با آب، بخش بزرگی از اثرات محافظتی آنها را تشکیل می­دهد.

به طور معمول، با یخ زدن آب، ساختار بلوری در حال گسترش، مانع تشکیل املاح به فرم شبکه­ای می­شود. املاح به فاز مایع در حال کاهش منتقل می­شوند که به طور موثر غلظت املاح را به سطوح کشنده در سلول افزایش می­دهد. از آنجایی که عوامل نفوذکننده از طریق پیوند هیدروژنی با آب برهمکنش قوی دارند، نقطه انجماد آب کاهش می‌یابد و مولکول‌های آب کمتری برای برهمکنش با خودشان برای تشکیل هسته‌­های حیاتی مورد نیاز برای تشکیل کریستال در­دسترس هستند.

تشکیل آب جامد با ساختار نامنظم و بی­شکل به عنوان انجماد شناخته می­شود و با استفاده از یک محافظ برودتی همراه با سرعت کاهش دما مناسب حاصل می­شود. برای به حداقل رساندن سمیت، مخلوطی از هر دو عامل نفوذکننده و غیرنفوذکننده اغلب به صورت مرحله­ای در دمای نزدیک به صفر درجه سانتیگراد اضافه می­شوند. بنابراین، افزودن عوامل نفوذ کننده در این شرایط امکان ذخیره موفقیت­ آمیز سلول­ها را در فاز جامد در دمای فوق­‌العاده پایین مورد­نیاز برای توقف فرآیندهای بیوشیمیایی بدون تشکیل یخ فراهم می­کند.

شکل 1. چهار محافظ متداول در برابر سرما: گلیسرول (GLY) دی متیل سولفوکسید (DMSO) اتیلن گلیکول (EG) و پروپیلن گلیکول (PG).

علاوه بر اجازه انجماد، برخی از PAها مانند DMSO تصور می‌شود که نفوذپذیری سلولی را با تأثیرگذاری بر دینامیک غشاء به روشی وابسته به غلظت افزایش می‌دهند. در غلظت‌های پایین (5%)، شواهد نشان می‌دهد که DMSO ضخامت غشا را کاهش می‌دهد و به نوبه خود، نفوذپذیری غشا را افزایش می‌دهد. در غلظت‌های رایج (10%)، تشکیل منافذ آب در غشاهای بیولوژیکی القا می‌شود.

تشکیل منافذ می­تواند سودمند باشد زیرا آب درون­سلولی را می­توان به آسانی با محافظ‌هایی که باعث افزایش انجماد می­شوند جایگزین ­کرد. با این حال، در غلظت‌های سمی بالاتر (40%)، دولایه‌های لیپیدی شروع به تجزیه شدن می‌کنند. بدیهی است که انتخاب یک غلظت مناسب برای محافظت از سرما برای یکپارچگی ساختاری و در نتیجه زنده­مانی سلول‌ها پس از انجماد حیاتی است.

عوامل غیر نفوذکننده (Non-permeating agents)

دسته دوم از انجمادها، عوامل غیر­تراوا یا غیرنفوذکننده(NPAs) هستند. همانطور که از نام آن پیداست، آنها به داخل سلول نفوذ نمی­کنند و بنابراین تأثیر محافظتی خود را در خارج از سلول اعمال می­کنند. آنها معمولاً بزرگتر هستند و به صورت کووالانسی به عنوان پلیمر، دایمر یا تریمر به هم متصل می­شوند. برخی از عوامل رایج در این کلاس عبارتند از: پلی­اتیلن­گلیکول (PEG) پلی­وینیل­پیرولیدون (PVP)، رافینوز، ساکارز و ترهالوز. عوامل غیر­تراوا با همان مکانیسم عوامل نفوذ­کننده اما خارج سلولی و به میزان کمتری انجماد را القا می­کنند.

ترهالوز: ساختار و پیامدهای منحصر به فرد

برخلاف پلیمرهای غیر­تراوا، CPA های دی‌ساکارید به طور طبیعی وجود دارند. ترهالوز، یک قند کمتر شناخته شده، توسط ارگانیسم­های مختلف از جمله باکتری­ها، قارچ‌ها، مخمرها، حشرات، گیاهان و برخی از بی­مهرگان تولید می‌شود. اگرچه عملکردهای زیادی دارد، اما ثابت ­شده­است که به عنوان وسیله­ای برای مقاومت در برابر انجماد در این موجودات عمل می­کند.

ساختار ترهالوز خواص مفیدی به آن می­دهد. این یک دایمر گلوکز است که از طریق یک پیوند α-1,1-glycosidic متصل شده است. پیوند استالی آن از کاهش C-1 در هر مونومر جلوگیری می­کند که باعث افزایش پایداری آن در دماهای شدید و کاهش حساسیت آن به هیدرولیز اسید در شرایط pH پایین می­شود. ساختار ترهالوز در شکل 2 نشان داده شده است:

شکل 2. دی ساکارید ترهالوز طبیعی. پیوند منحصر به فرد α-1,1-glycosidic از هیدرولیز C-1 جلوگیری می­کند و پایداری را در شرایط دمایی و شرایط pH پایین افزایش می­دهد.

 

ترکیب هر دو عامل

هر دو عامل نفوذکننده و غیرتراوا می­توانند در غلظت­های بالاتر برای سلول­ها سمی باشند، اگرچه عوامل غیرتراوا در درجه پایین­تری نسبت به نفوذکننده­ها سمی هستند. این ویژگی نامطلوب CPA ها باعث افزایش مرگ سلولی و کاهش زنده­مانی می­شود. از آنجایی که هم PAها و هم NPAها مکانیسم انجماد یکسانی دارند، می‌توان عوامل غیرتراوا را به محلول اضافه کرد تا یه ترکیب محافظ انجمادی موفق اما با غلظت‌های پایین‌تر از عوامل نفوذکننده، فراهم شود.

این مزیت باعث کاهش سمیت ناشی از PA و افزایش زنده­مانی سلولی پس از ذوب است. روش دیگری که کاهش سمیت ناشی از CPA را نشان داد توسط Kojayan و همکارانش بود که در آن ترکیبات چند مولاری از غلظت­های کاهش­یافته EG و DMSO برای انجماد سلول­های انسان و موش استفاده شد. آنها پیشنهاد کردند که کاهش اثرات نامطلوب احتمالاً به دلیل کاهش قرارگرفتن در معرض هر یک از CPA است، اگرچه اسمولالیته کلی ترکیبات مختلف با یک محلول استاندارد مولار 2 از DMSO قابل مقایسه بود.

مطالعات دیگر نشان­داده‌اند که ترکیبی از ساکارز، پروپاندیول و DMSO در حمایت از بقای بلاستوسیست‌های خوک پس از گرم شدن مؤثر است. اگرچه استفاده مجزا از EG و DMSO از اواسط دهه 1900 الگویی در انجماد بوده است، تحقیقات جدیدتر نشان می­دهد که ترکیبی از این و سایر CPAها بالاترین قابلیت زنده­مانی سلولی را پس از انجماد ارائه می­دهد.

نرخ­ های کاهش دما و ذوب­ کردن

دومین اقدامی که باید در طول فرآیند انجماد انجام شود، انتخاب نرخ کاهش دما و ذوب شدن است. از آنجایی که موفقیت محافظت در برابر سرما به اجتناب از تشکیل یخ درون سلولی بستگی­ دارد، باید توجه دقیقی به حرکت آب در طول غشاها در طول این فرآیند صورت گیرد. Mazur وابستگی بقا به سرعت کاهش دما سلول ­های مختلف را نشان­ داد. به طور خاص، او شواهدی ارائه کرد مبنی بر اینکه سرعت کاهش دما، متناسب با احتمال تشکیل یخ درون سلولی است و بنابراین با بقای آن نسبت معکوس دارد.

برای کاهش احتمال تشکیل یخ درون سلولی، با کاهش دمای سلول، آب باید از سلول خارج شود. نیروی ­محرکه مسئول حرکت آب به بیرون، اختلاف فشار ناشی از کاهش دمای بسیار زیاد آب درون سلولی است. این آب زیر صفر درجه سانتیگراد در فاز مایع باقی می­ماند؛ پدیده­ای که با کاهش نقطه انجماد ناشی از حضور CPA ها افزایش می­یابد. آب خیلی سرد در سیتوپلاسم دارای فشار بخار نسبتاً بالایی در مقایسه با آب در محیط خارجی است. اختلاف فشار حاصله باعث حرکت خالص آب به خارج از سلول می­شود و باعث دهیدراته شدن می­شود.

یک اختلاف فشار برای حرکت آب ضروری است، اما این تنها عامل دخیل نیست. مقدار آب باقیمانده در سلول در زمان انجماد تحت تأثیر سرعت خروج آب در مرحله کاهش دما است. سه متغیری که بر این سرعت تأثیر می‌گذارند عبارتند از، نسبت سطح سلول به حجم (SA: V) نفوذپذیری غشاء به آب و سرعت خنک‌شدن.

SA: V تابعی از اندازه ذاتی یک سلول است و قابل تغییر نیست. با این حال، مهم است که اذعان کنیم، پیامدهای مهمی وجود دارد. یعنی دهیدراته شدن سلول­های بزرگتر در مقایسه با دهیدراته ­شدن سلول­های کوچکتر ذاتاً کند است. با توجه به این موضوع، تنظیمات در طول انجماد باید بر اساس اندازه سلول در نظر گرفته شود تا اجازه خروج حجم کافی از آب قبل از انجماد را بدهد. برای جبران اندازه سلول­های بزرگ، به عنوان مثال در سلول­های کبدی که قطر آنها 30-20 میکرومتر است، دو متغیر باقی­مانده را می­توان تغییرداد.

ابتدا، همانطورکه قبلاً در مورد آن صحبت شد، می­توان نفوذپذیری غشاء را با افزودن برخی از عوامل انجمادی نفوذی مانند DMSO افزایش داد. دوم، سرعت کاهش دما را می­توان کاهش داد. رابطه بین کم آبی و سرعت کاهش دما کمتر مشهود است اما با این وجود حیاتی است. با کاهش دما، انرژی جنبشی درون سلولی نیز کاهش می­یابد. کاهش دما سریع، زمان کافی را برای خروج آب قبل از وقوع انجماد باقی نمی‌گذارد، بنابراین محتوای آب درون سلولی بالا باقی­ می‌ماند و احتمال کریستالیزاسیون بیشتر است.

برای اطمینان از حداکثر بقا، سرعت کاهش دما تقریباً ۱ درجه سانتی­گراد در دقیقه معمولاً برای اکثر سلول‌ها به جز سلول‌های بسیار بزرگ مناسب است. این فعل معمولاً با استفاده از فریزرهایی با نرخ کنترل شده به دست می­آید که دمای محفظه را از طریق برنامه های کاهش دما پیچیده تعدیل می­کنند تا ^oC/min1 افت ثابت محتوای ویال را حفظ کنند. پس از انجماد یا فریز موفقیت آمیز، انتظار می­رود که سلول­ها برای استفاده بعدی ذخیره و ذوب شوند.

با این حال، در مقایسه با کاهش دما، به شرایط ذخیره­سازی و ذوب سلولی یا دیفریز توجه کمتری شده است. حدس و گمان در مورد اینکه چرا این مورد منجر به چندین نتیجه ممکن می­شود: تئوری پیرامون شرایط ذخیره­سازی و سرعت ذوب در حال حاضر به خوبی در جامعه علمی جا­افتاده­است، و انتظار می­رود که سلول­های اولیه به مدت طولانی در دمای 140- تا 196- درجه سانتیگراد ذخیره شوند. همچنین ذکر این نکته مهم است که نوع ذخیره­سازی می­تواند بر سلامت و بازیابی سلول تأثیر بگذارد.

به عنوان مثال، ذخیره سلول­های کبدی اولیه در فاز بخار مخزن LN2 (نیتروژن مایع) در دمای 140- درجه سانتیگراد نسبت به مخازن استاندارد LN2 مایع در دمای 196- درجه سانتیگراد ترجیح داده می­شود. نشان داده شده است که ذخیره­سازی فاز بخار LN2 امکان بازیابی بسیار بیشتر سلول­های کبدی زنده را فراهم می­کند و عملکرد متابولیک کبد را حفظ می­کند.

ذوب و گرم شدن سلول‌ها به اندازه کاهش دما در فریز نقش حیاتی ندارد. تئوری رایج این است که سلول­ها باید به سرعت گرم شوند تا از ایجاد کریستال یخ جلوگیری شود. منطق این ایده براساس اصول ترمودینامیکی است و به شرح زیر است: آب منجمد­شده در حالت انرژی بالاتر در مقایسه با شکل کریستال آن وجود دارد.

این فقط شبه پایدار است و بنابراین می­تواند خود را به یک ساختار کریستالی با ثبات­تر و کم­انرژی در طول ذوب مجددا بازآرایی کند. با این حال، هنگام اندازه‌گیری تأثیر سرعت گرم شدن بر زنده‌مانی، مهم است که به یاد داشته باشید که دو مرحله همیشه قبل از ذوب شدن است: افزودن مواد محافظ انجماد و متعاقباً سرعت کاهش دما سلول‌ها.

هر دوی اینها تأثیر قابل توجهی بر زنده­مانی دارند و می­توانند بقای سلول­ها پس از گرم­شدن را مخدوش کنند. با این وجود، پروتکل‌های پذیرفته شده فعلی پیشنهاد می‌کنند که کریوویال‌ها روی بخار LN2 (نه روی یخ یا یخ خشک) به آزمایشگاه منتقل شوند و به سرعت در حمام آب 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 90 تا 120 ثانیه گرم شوند تا حداکثر زنده‌مانی حاصل شود.

این عمل به یک نرخ تقریبی گرمایش 45-70 درجه سانتیگراد در دقیقه، بین 140- درجه سانتیگراد و صفر درجه سانتیگراد ترجمه می­شود، اگرچه نرخ گرم­شدن به دلیل ماهیت غیرخطی آن در خارج از این دامنه و کم و بیش سریع است. با این حال، حداقل یک مطالعه، شواهدی را ارائه کرد که نشان می‌دهد گرم شدن سلول‌ها در هر نقطه بین 2 درجه سانتیگراد در دقیقه تا 100 درجه سانتیگراد در دقیقه، هیچ تأثیری بر زنده‌مانی پس از ذوب ندارد.

اگر درست باشد، نمونه‌ها را می‌توان با سرعت‌های آهسته‌تری مانند آنچه با ذوب در دمای هوا به دست می‌آید (6.2 ± 0.5 درجه سانتیگراد در دقیقه) ذوب کرد. با این رویکرد، زنده­مانی نمونه‌ها برابر با نمونه‌هایی است که تحت پروتکل‌های استفاده از حمام آب و ذوب سریع قرار می‌گیرند. با این حال، کاهش استفاده از حمام آب نیز مزیت بیشتری برای افزایش استریل بودن خواهد داشت زیرا آنها یکی از رایج ترین منابع آلودگی در آزمایشگاه هستند.

در نهایت، توجه به این نکته ضروری است که مهم نیست که سلول‌ها چقدر خوب ذخیره می­شوند یا چگونه ذوب می­شوند؛ کاهش زنده­مانی پس از ذوب اجتناب­ناپذیر است.

انجماد سلول‌های کبدی، جزایر پانکراس، گامت‌ها و سلول‌های بنیادی

پاسخ‌های کرایوبیولوژیکی بسته به نوع سلول به دلیل تغییرات در ترکیب سلولی و بافتی می­تواند بسیار متفاوت باشد. بنابراین، ویژگی‌های بیوفیزیولوژیکی و بیولوژیکی اختصاصی سلول باید در طول انجماد در نظر گرفته شود تا بقای پس از کرایو برای هر نوع سلول به حداکثر برسد. بخش‌های زیر ملاحظات انجماد اختصاصی سلول، از جمله سرعت کاهش دما و ذوب بهینه، و انتخاب CPA مناسب برای سلول‌های کبدی، جزایر پانکراس، اسپرم، تخمک‌ها و سلول‌های بنیادی را مورد بحث قرار می‌دهند.

سلول ­های کبدی(Hepatocytes)

پیوند هپاتوسیت، که شامل تزریق سلول‌های کبدی بالغ در سیستم پورتال گیرنده است، یک رویکرد درمانی جدید است که می‌تواند برای درمان انواع مختلف بیماری‌های کبدی استفاده شود. انجماد هپاتوسیت یک مرحله حیاتی در این روش درمانی است زیرا اغلب یک تاخیر ضروری بین جداسازی سلول اولیه و فرآیند پیوند بیمار وجود دارد. علاوه بر این، اکثر بیماران به چندین پیوند سلولی در یک دوره طولانی نیاز دارند که بهینه‌سازی تکنیک‌های انجماد برای کمک به حفظ عملکرد سلول مهم‌تر می‌شود.

عوامل متعددی بر نتایج انجماد تأثیر می‌گذارند، از جمله: کیفیت بافتی که سلول‌های کبدی از آن مشتق شده‌اند، خود روش استخراج، محیط نگهداری و نرخ انجماد/ذوب. کیفیت سلول‌های کبدی تحت تأثیر وجود بافت‌های استئاتوتیک یا سایر بافت‌های بیمار و همچنین زمان‌های ایسکمی طولانی‌مدت قرار می‌گیرد، که هر دو می‌توانند کیفیت سلول‌های کبدی استخراج شده را به خطر بیندازند. در مرحله بعد، روش استخراج سلولی خود می‌تواند استرس اکسیداتیو را القا کند که به نوبه خود بر نتایج انجماد تأثیر منفی می­گذارد.

پیشنهاد شده است که قبل از انکوبه­کردن در شرایط کشت معلق در محیط­های حاوی 2 میلی مولار Nاستیل­سیستئین (یک آنتی اکسیدان) و 15 میلی مولار گلوکز می­تواند پس از استخراج محافظت آنتی­اکسیدانی ایجاد کند و نتایج پس از انجماد از جمله زنده­مانی سلول را بهینه ­کند. محیط انجماد همچنین می‌تواند بر نتایج ذخیره‌سازی تأثیر بگذارد و دانشگاه ویسکانسین (UW) در حال حاضر محیط استاندارد برای حفظ سلول‌های کبدی در نظر گرفته می‌شود.

به عنوان جایگزینی برای محلول UW، محلول انجماد HypoThermosol (HTS) همراه با 10٪ DMSO در دمای 4 درجه سانتیگراد نشان داده شده است که زنده­مانی سلولی بالا، عملکرد طولانی مدت هپاتوسیت و پاسخ با کیفیت خوب به سیتوکین پس از ذوب را ایجاد می‌کند. علاوه بر این، ترکیب NPA مانند ترهالوز و CPA مانند DMSO به طور قابل توجهی زنده‌مانی سلول­‌های کبدی انسان و موش را پس از ذوب افزایش می­دهد.

نرخ ذوب و انجماد نیز نقش مهمی در تعیین نتیجه انجماد دارد. سرعت کاهش دما آهسته بهترین تکنیک برای انجماد سلول­های کبدی جدا شده بالغ است. در مطالعات مختلفی که از DMSO به عنوان CPA خود استفاده کرده‌اند، نرخ‌های کاهش دما مختلفی را پیشنهاد کرده‌اند که از⁰C/MIN 5- تا 1- تا 80- تا 40- درجه سانتیگراد در دقیقه قبل از ذخیره‌سازی در دمای ºC 196 – در نیتروژن مایع متغیر است. ذوب سریع در دمای 37 درجه سانتیگراد برای جلوگیری از تشکیل یخ درون سلولی، به حداقل رساندن آسیب سلولی و افزایش زنده مانی پس از ذوب توصیه می شود.

پس از ذوب، ارزیابی قابلیت زنده­‌مانی و عملکرد سلول­ های کبدی منجمد شده مهم است. اتصال سلول‌های کبدی پس از ذوب به پلیت­ های پوشش داده ­شده با کلاژن، اندازه‌گیری سریع و کیفی زنده‌مانی سلولی را فراهم می‌کند و سنجش‌هایی مانند رنگ ­آمیزی تریپان­بلو، آزادسازی لاکتات­دهیدروژناز، عملکرد میتوکندری و اندازه‌گیری نشانگرهای نکروزه یا آپوپتوز امکان ارزیابی کمی زنده‌مانی و عملکردی را می‌دهد.

سنجش‌هایی که عملکرد آنزیم CYP450 پس از ذوب را ارزیابی می­کنند، مانند سنجش‌های 7-ethoxyresorufin-O-deethylase و تستوسترون، و همچنین متابولیسم فاز II از طریق کونژوگاسیون رزوروفین نیز می­توانند مورد استفاده قرار گیرند. این سنجش‌ها را می­توان برای تعیین اینکه آیا قابلیت های متابولیسم دارویی سلول‌های کبدی پس از ذوب دست نخورده باقی می­ماند یا خیر استفاده کرد.

سلول‌های کبدی برای افزایش بیشتر عملکرد و زنده­ مانی، همچنین می‌توانند برای محافظت در برابر عوامل استرس‌زای مکانیکی در طول انجماد، کپسوله شوند. یک مطالعه، تفاوت معنی­داری را بین زنده‌مانی قبل و بعد از انجماد زمانی که سلول­های کبدی انسان با میکروکپسول­های آلژینات/پلی-ال-لیزین کپسوله شدند گزارش نکرد. کپسوله کردن سلول‌های کبدی همچنین محافظت در برابر دفاع ایمنی میزبان را ارائه می‌کند که یک ویژگی جذاب برای سلول‌هایی است که برای پیوند پس از انجماد قرار می‌گیرند.

جزایر پانکراس (Pancreatic islets)

پیوند جزایر یک درمان موثر برای درمان بیماران مبتلا به دیابت شیرین نوع I پیچیده است. پیشرفت‌هایی در استخراج و پیوند جزایر بالینی از زمان توسعه پروتکل ادمونتون در سال 2000 صورت ­گرفته ­است. گزارش شده است که پیوند جزایر بالینی می­تواند انسولین را تا 5 سال پس از پیوند با حداقل عوارض ایجاد کند.

با­ این ­حال، در دسترس­بودن محدود اهداکننده پانکراس و جزایر مناسب برای پیوند همچنان یک چالش باقی­مانده­است. بانکداری انجمادی سلول‌های پانکراس از اهداکنندگان متعدد امکان ذخیره‌سازی طولانی‌مدت جزایر را فراهم می‌کند و به موضوع در دسترس بودن اهداکننده برای پیوند جزایر می‌پردازد. جزایر را می­توان در دمای 80- تا 196- درجه سانتیگراد با DMSO انجماد کرد.

نرخ انجماد و ذوب می­تواند بر مورفولوژی و عملکرد جزایر تأثیر بگذارد. یک نرخ انجماد بهینه باید عملکرد و زنده­مانی بالایی را فراهم کند و در عین حال مولکول‌های تحریک‌کننده ایمنی را پایین نگه دارد. فورمن(Foreman) و همکارانش گزارش دادند که انجماد سریع با سرعت 20 درجه سانتیگراد در دقیقه و 70 درجه سانتیگراد در دقیقه زمانی که جزایر در 1 مولار DMSO به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق کشت داده شدند و به دنبال آن قرار گرفتن در معرض 2 مولار DSMO به مدت 10 دقیقه در دمای 0 درجه سانتیگراد، توانایی ترشح انسولین در سلول­ های جزایر پس از ذوب در شرایط آزمایشگاهی را بهبود بخشید.

پروتکل­های استاندارد فعلی ذوب جزایر شامل ذوب سریع در دمای 150-200 درجه سانتیگراد در دقیقه در حمام آب 37 درجه سانتیگراد است. شواهد نشان می­دهد که قرارگرفتن در معرض 50٪ اکسیژن در طول فرآیند ذوب می­تواند آسیب جزایر انسانی را کاهش دهد. گلیسرول یا DMSO را می­توان به عنوان CPA برای ذخیره­سازی طولانی مدت سلول­ های جزایر در دمای زیر صفر (معمولاً کمتر از 100- درجه سانتی گراد) استفاده کرد.

چاندراوانشی(Chandravanshi) استفاده از مکمل های دوکوزاهگزانوئیک اسید (DHA)، ایکوزاپنتانوئیک اسید (EPA) و متفورمین را پیشنهاد ­کرد که می‌تواند بازیابی جزایر بیشتری را از ذخیره‌سازی 196- درجه سانتی‌گراد فراهم کند و امکان بانک‌داری مناسب جزایر را فراهم کند. علاوه بر انتخاب CPA ها و بهینه سازی نرخ انجماد و ذوب، روش‌های دیگری برای بهبود نتایج انجماد جزایر توسعه داده شده است.

کپسوله کردن آلژینات جزایر قبل از انجماد نشان داده است که یک رویکرد امیدوارکننده برای پیوندهای آینده است. یک مطالعه نشان داد که در مقایسه با جزایر یخ زده کپسوله نشده، جزایر کپسوله شده در 1.75 درصد آلژینات، بقا و عملکرد بالاتری پس از ذوب و همچنین پاسخ پیوند بهبود یافته بهتری داشتند.

بقای جزایر پس از ذوب را می­توان با روش‌های متعددی از جمله فلورسین­دی­استات (FDA)، کلسین AM، یا رنگ­آمیزی SYTO Green به همراه رنگ­آمیزی یدید­پروپیدیوم (PI) یا رنگ اتیدیوم­بروماید (EtBr) ارزیابی کرد. علاوه بر این، آسیب پس از ذوب به سلامت کلی جزایر پایه می‌تواند از طریق کمی‌سازی رونوشت‌های mRNA مبتنی بر PCR از جمله: HIF1A (فعال‌شده در شرایط هیپوکسیک)، SLC2A1 (انتقال‌دهنده GLUT1)، و ACTB (بتا اکتین/اسکلت سلولی) پایش شود.

اختلال در توانایی متابولیک و عملکرد جزایر را می­توان از طریق مقایسه دقیق میزان مصرف اکسیژن پس از ذوب (OCR) و تولید انسولین (GSIR) با سطوح پایه قبل از کرایو ارزیابی­کرد. در نهایت، بهینه‌سازی پارامترهای انجماد می‌تواند شکاف بین پیوند از اهداکننده به گیرنده را کاهش دهد و پیوند بالینی سلول‌های جزایر را برای درمان دیابت نوع I بیشتر پیش ببرد.

اسپرم

انجماد اسپرم یک روش موثر برای حفظ باروری در انسان است و به ویژه برای بیماران قبل از درمان سرطان و سایر پستانداران از جمله گونه‌های در معرض خطر مفید است. اسپرم‌ها به قدری از این روش ذخیره‌سازی پیروی می‌کنند که یک مطالعه گزارش ­داد که دسته‌ای از سلول‌ها که به مدت 21 سال نگهداری می‌شدند برای بارور کردن موفقیت‌آمیز یک تخمک که در نهایت منجر به تولد زنده می‌شد، استفاده شد.

نگهداری طولانی مدت این سلول­ها معمولا شامل گلیسرول و یا زرده تخم­ مرغ به عنوان CPA است و افزایش غلظت گلیسرول با سرعت کاهش دما ثابت باعث افزایش نرخ بقای اسپرم می­شود. برای انجماد سلول‌های اسپرم انسانی، سرعت خنک‌سازی اولیه ºC/min 0.5-1 هنگام انجماد سلول‌ها از دمای اتاق تا ºC 5 توصیه می‌شود.

پس از آن، افزایش نرخ انجماد به 10 درجه سانتیگراد در دقیقه هنگام سرد شدن از 5 تا 80- درجه سانتیگراد برای به حداکثر رساندن انجماد اسپرم توصیه می­شود. هنگام ذوب نمونه‌ها، نرخ‌های 43.5 درجه سانتیگراد در دقیقه در هوای 20 درجه سانتیگراد یا 55.2 درجه سانتیگراد در دقیقه در هوای 35 درجه سانتیگراد روی سطح خشک پیشنهاد می‌شود تا منجر به زنده­ماندن و تحرک مطلوب اسپرم پس از ذوب شود.

به طورکلی، آسیب ­های رایج پس از ذوب اسپرم شامل کاهش یکپارچگی آکروزوم، تحرک، قابلیت لقاح، و کاهش کلی در زنده­مانی بدون در نظر گرفتن گونه منشا می­باشد. به طورخاص، اختلال کروماتین از طریق جابجایی های پروتامین، تکه تکه شدن DNA و ضایعات به ژن‌های دخیل در قابلیت لقاح و رشد جنینی (ADD1، ARNT، PEG1/MEST، SNORD116/PWSAS) از پیامدهای شناخته شده فرآیند انجماد هستند.

اگرچه مکانیسم دقیق ناشناخته است، تصور می‌شود که استرس اکسیداتیو رایج در طول فرآیند کرایو باعث افزایش تکه تکه شدن DNA در اسپرم انسان می‌شود و در نتیجه منجر به کاهش بازده و زنده­مانی نهایی می‌شود. Yeste و همکارانش مکمل محیط های انجمادی با ویتامین E، هیپوتورین یا سایر آنتی ­اکسیدان­‌های طبیعی برای کمک به کاهش اثرات اکسیداتیو را پیشنهاد کرده­ است. درحالی که تغییرات ژنتیکی ناشی از سرما در اسپرم مستند شده است، داده‌های مربوط به تغییرات اپی ژنتیکی بالقوه ناشی از انجماد محدود است و نیاز به مطالعه بیشتر دارد.

علاوه بر این، تحرک و زنده­مانی اسپرم قبل از کرایو می­تواند به پیش­بینی نتایج پس از ذوب و بقای سرما کمک کند. Degl’Innocenti و همکارانش این ویژگی­ها را در نمونه­ هایی از بیماران مبتلا به الیگواسپرمی، سرطان و سایر آسیب شناسی­ها ارزیابی ­کردند. آنها گزارش دادند که کمترین میزان بهبودی زمانی رخ می­دهد که تعداد، تحرک و زنده­مانی قبل از کرایو به کمتر از سطح پنجم سازمان جهانی بهداشت (WHO) برسد.

مقادیر مرجع صدک (39 × 10⁶ اسپرم در هر انزال، تحرک کل: 40٪، تحرک پیشرونده: 32٪، و زنده­مانی: 58٪). علاوه بر ویژگی ذاتی و کیفیت نمونه اسپرم، دوره نگهداری مایع اسپرم قبل از انجماد حیاتی است. برای تحرک مطلوب پس از ذوب، توصیه می­شود که نمونه باید ظرف یک ساعت پس از انزال پردازش شود. عوامل دیگری که باید در نظر گرفته شوند عبارتند از تحرک اولیه اسپرم حداقل 55 درصد در یک ساعت پس از انزال با اکثر سلول­ها در حرکت رو به جلو، کمتر از 15 درصد کاهش در تحرک اسپرم و عدم کاهش قابل توجه حرکت رو به جلو 4 ساعت پس از انزال.

تخمک

انجماد تخمک یک روش قابل اعتماد برای حفظ باروری در زنانی است که تحت درمان برای شرایط پزشکی مانند سرطان یا بیماری‌های خودایمنی هستند. درمان این بیماری­ها می­تواند منجر به نارسایی تخمدان شود که نشان دهنده اهمیت حفظ باروری است. نگرانی­ های اخلاقی و قانونی در مورد انجماد جنین منجر به پیشرفت­های تحقیقاتی در انجماد تخمک در چند سال گذشته به عنوان یک رویکرد جایگزین شده است.

انجماد تخمک­ها استقلال را برای زنان فراهم می­کند زیرا امکان حفظ باروری انتخابی را در مقایسه با حفظ جنین فراهم می­کند. علاوه بر این، انجماد تخمک به زنانی که نگرانی در مورد کاهش باروری مرتبط با افزایش سن دارند، گزینه­ای برای به تاخیر انداختن بارداری را ارائه می­دهد.

انجماد تخمک­های انسانی تقریباً به طور انحصاری در مرحله متافاز II انجام می­شود، زمانی که بلوغ هسته­ای و سیتوپلاسمی کامل ­شده ­است. اندازه بزرگ، محتوای آب بالا و ترکیب درون سلولی منحصر به فرد تخمک­ها، انجماد را چالش برانگیز می­کند، با این حال آسیب به دوک­های میوز، رشته­ های اکتین، و DNA علاوه بر پراکندگی کروموزوم، پلیمریزاسیون میکروتوبولی و افزایش نرخ پلی­اسپرم از جمله چالش‌های خاصی هستند که با حفظ تخمک ایجاد می‌شوند.

به نظر می­رسد مانند اسپرم، تخمک­ها نیز به تغییرات اپی­ژنتیکی در نتیجه ذخیره­ سازی در دمای پایین حساس هستند، اگرچه تحقیقات در این زمینه ادامه دارد.

در حال حاضر دو رویکرد برای انجماد تخمک غالب است. آنها شامل کاهش دما آهسته (پروتکل‌های انجمادی تعادلی) و انجماد سریع (سرد شدن فوق سریع یا پروتکل­های غیرتعادلی) می­شوند. کاهش دما آهسته شامل دهیدراته­شدن تدریجی سلول با افزودن غلظت‌های پایین یک عامل نفوذکننده مانند DMSO (معمولاً M 1.5) و یک عامل غیرنفوذکننده (معمولاً ساکارز یا ترهالوز، ≤ M 0.3) با سرعت کاهش دما آهسته کنترل‌شده است.

پس از سردشدن تا دمای 150- درجه سانتیگراد، سلول­ها در نیتروژن مایع در دمای 196- درجه سانتیگراد ذخیره می­شوند تا زمانی که برای استفاده مورد نیاز باشند. بقای انجماد تخمک­ها با بهبود پروتکل­های کاهش دما آهسته، به ویژه با نقش غلظت ساکارز بیش از 0.1 مولار در طول دهیدراته شدن قبل از انجماد افزایش یافته است. با این حال، شواهد حاصل از تمرین گسترده نشان می‌دهد که نرخ بقا با این روش حدود 70 تا 80 درصد است.

با این حال، پروتکل‌های منجمدسازی در حال حاضر بهترین روش برای انجماد تخمک‌ها در نظر گرفته می‌شوند. رایج‌ترین روش منجمدسازی شامل افزودن گام به گام CPAs در کرایومدیا است. در مرحله اول تعادل، تخمک‌ها به مدت 5 تا 15 دقیقه به محلولی حاویv/v  7.5% از EG و v/v 7.5% از DMSO اضافه می­شوند.

سپس سلول­ها در معرض محلول انجماد با v/v15% از EG و 15% v/v از DMSO، به اضافه 0.5 مولار ساکارز قرار می­گیرند. پس از یک انکوباسیون کوتاه (≤ 1 دقیقه)، سلول­ها در نیتروژن مایع در دمای 196- درجه سانتیگراد ذخیره می­شوند. گرم­کردن باید به سرعت انجام شود تا از تشکیل کریستال یخ جلوگیری شود و پس از حذف تدریجی CPA، سلول­ها باید تا زمان استفاده در محیط کشت انکوبه شوند. یک بررسی سیستماتیک گزارش داد که میزان بقا و لقاح تخمک در تخمک‌های منجمد شده به روش کاهش دما سریع بیشتر از تخمک‌های با روش کاهش دما آهسته بود.

انجماد سریع همچنین منجر به یک جنین با کیفیت بالاتر (22.4٪ در مقابل 8.0٪) و نرخ تقسیم بالاتر (در روز 2: 64.6٪ در مقابل 47.7٪) در مقایسه با کاهش دما با سرعت آهسته شد. علاوه بر این، میزان حاملگی در حال انجام، جنین با کیفیت بالا، تقسیم جنینی و لقاح بین تخمک­های منجمدشده و تازه تفاوت معنا داری نداشت. این یافته‌ها نشان می‌دهند که کاهش دما سریع روش بهتری برای انجماد تخمک است.

سلول‌های بنیادی

توانایی سلول‌های بنیادی برای تمایز به فنوتیپ‌های سلولی مختلف، پایه‌ای را برای سلول‌درمانی‌های بازسازی‌کننده از جمله درمان بیماری‌های دژنریتیو و آسیب‌های تروماتیک فراهم می‌کند. درمان‌های مبتنی بر سلول­های بنیادی امکان ترمیم ساختار بافت و بازیابی عملکردی را فراهم می‌کند. علاوه براین، بیومولکول­های سنتز شده توسط سلول­های بنیادی می­توانند به ترمیم بافت کمک کنند.

سلول­های بنیادی خونساز (HSCs) را می­توان برای درمان بیماری­های هماتولوژیک و همچنین بیماری­های غیرهماتولوژیک استفاده کرد. خواص تعدیل­کننده ایمنی و سرکوب­کننده سیستم ایمنی سلول­های بنیادی مزانشیمی (MSCs) این نوع سلول را برای پیوند آلوژنیک ایده­آل می­کند. علاوه بر کاربردهای بالینی آنها در بازسازی و پیوند بافت، سلول­های بنیادی جنینی انسان (ESCs) در تحقیقات برای مطالعه فرآیندهای رشد اولیه و مسیرهای سیگنالینگ سلولی استفاده می‌شوند.

به منظور گسترش بیشتر کاربردهای بالینی سلول­های بنیادی، باید از پروتکل­های بانکداری کرایوژنیک طولانی مدت پیروی کرد که برای هر نوع سلول بنیادی مناسب باشد. پروتکل‌های انجماد برای HSCها و MSCها از روش‌های کاهش دما آهسته سنتی پیروی می‌کنند، در حالی که پروتکل‌های ESC از رویکرد کاهش دما سریع پیروی می‌کنند.

رویکرد استاندارد برای حفظ انجماد HSCها شامل استفاده از DMSO به عنوان CPA، نرخ کنترل­شده انجماد در 1 تا 2 درجه سانتیگراد در دقیقه و ذوب سریع است. سلول‌های بنیادی مزانشیمی را می‌توان به طور مشابه با استفاده از پروتکل‌های انجماد آهسته و DMSO به عنوان CPA، انجماد کرد.

روش‌های مرسوم (DMSO و کاهش دما آهسته)، با این حال، راندمان پایینی را برای انجماد ESCs نشان داده‌اند. در نتیجه، پروتکل­های انجماد برای انجماد ESCs توسعه داده­ شده ­است. نرخ بازیابی بالاتری برای ESCهای منجمدشده با کاهش دما سریع در مقایسه با سلول‌هایی که با پروتکل‌های کاهش دما آهسته منجمد شده‌اند گزارش شده است (۷۵٪ در مقایسه با حدود ۵٪).

یک پروتکل دقیق برای انجماد ESCهای انسانی شرح داده شده است. به طور خلاصه، ESC های انسانی در معرض افزودن گام به گام دو محلول انجماد با افزایش غلظت CPA قرار می­گیرند. اجزای مشترک هر دو محلول شامل DMSO و EG است. ترکیب محلول می­تواند با تفاوت در غلظت ساکارز و وجود یا عدم وجود سرم و بافر مورد استفاده متفاوت باشد.

کلنی‌های ESC انسانی به ترتیب به مدت 60 و 25 ثانیه در دمای اتاق یا 37 درجه سانتیگراد در معرض دو محلول انجماد قرار می‌گیرند. علاوه بر این، پیشنهاد شده است که نرخ کاهش دما بالاتر در فرآیندهای انجماد غیرتعادلی می‌تواند اجازه استفاده از غلظت کل کمتری از CPA را بدهد و ترکیبی از CPA می‌تواند به کاهش اثرات سمی آنها کمک ­کند. Reubinoff و همکارانش ترکیبی از DMSO 20% ، EG 20% و 0.5 مولار ساکارز با سرعت کاهش دما سریع را پیشنهاد کردند.

مانند سلول‌های کاملاً تمایز­یافته، سلول‌های بنیادی در معرض تغییرات نامطلوب در ساختار و عملکرد پس از انجماد قرار می‌گیرند. یک مرور سیستماتیک اخیر ارزیابی‌های پس از ذوب سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان را در ده گونه از 41 مطالعه جداگانه مقایسه کرد. نویسندگان یک توافق کلی را گزارش ­کردند که مورفولوژی، ایمونوفنوتیپ، تمایز و پتانسیل تکثیر تا حد زیادی تحت تأثیر انجماد قرار نگرفتند، اما دو سوم آزمایش‌ها کاهش فعالیت متابولیکی را پس از انجماد گزارش ­کردند.

بعلاوه، تغییرات گزارش شده در زنده­مانی متفاوت بود به طوری که تقریباً 43٪ از مطالعات بدون تغییر گزارش کردند و 27٪ گزارش ­دادند که زنده مانی به طور قابل توجهی کاهش­یافته­است. کاهش زنده‌مانی پس از کرایو و فعالیت متابولیک اغلب نتیجه آسیب سلولی فیزیکی و مولکولی است. صدمات فیزیکی شامل تشکیل یخ درون سلولی، اثرات محلول، سمیت محلول کرایو و آسیب مولکولی است که به صورت تغییرات در بیان ژن، القای پاسخ استرس و تغییرات اپی­ژنتیکی ظاهر می­شود.

مکانیسم‌های مولکولی پشت پاسخ‌های ژنتیکی به انجماد در سلول‌های بنیادی، دقیقاً مانند پاسخ‌های گامتتیک، کاملاً شناخته شده نیستند و هنوز حوزه‌ای برای تحقیقات فعال هستند. در نهایت، چندین سنجش برای ارزیابی بقای سلول پس از انجماد وجود دارد که شامل تست یکپارچگی غشاء، سنجش فعالیت متابولیکی و مکانیکی، و سنجش فعالیت میتوزی می‌شود. برای تعیین عملکرد درون تنی سلول‌های منجمد شده، سنجش‌های لقاح و رشد و همچنین سنجش‌های پیوند را می‌توان انجام داد.

عوامل جدید، و بیومواد برای بهبود زنده‌مانی

رویکردهای جدیدتر برای حفظ انجماد سلولی افزایش زنده­مانی و بازدهی پس از ذوب را هنگامی که سلول­ها قبل از انجماد کپسوله می‌شوند، نشان می­دهد. یکی مثال استفاده از کپسوله‌سازی آلژینات سلول‌های کبدی برای افزایش موفقیت در انجماد است. در ترکیب با محلول دانشگاه ویسکانسین10٪ DMSO +(UW)  + 5٪گلوکز، میکروبیدهای سلولی کپسوله شده پس از ذوب زنده­مانی بهتری نسبت به سلول­های غیرکپسوله شده نشان دادند.

همین رویکرد را می‌توان بر روی انواع دیگر سلول‌ها برای بهبود عملکرد انجماد آزمایش کرد. این اثر با استفاده از بازدارنده پان کاسپاز (benzyloxycarbonyl-Val-Ala-dl-Asp-fluoromethylketone [ZVAD])  بیشتر بهبود می­یابد. یک مطالعه جدیدتر نیاز به آلژینات را دور می­زند، به جای آن، سلول­های کبدی را به صورت قطرات در مخلوط CPA منجمد می­کند (UW مکمل با 2 میلی­گرم در میلی­لیتر BSA، V/V DMSO 32.5٪ ، V/V EG 32.5٪ ، و 800 میلی­مولار ساکارز).

قطرات به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شدند، که در مقایسه با انجماد آهسته که معمولاً برای انجماد استفاده می‌شود، غیرمعمول است. سلول‌های کبدی منجمد شده با قطرات حجیم، زنده‌مانی، مورفولوژی بهتر و فعالیت متابولیکی بالاتری نسبت به سلول‌های کبدی منجمد غیرقطره‌ای داشتند. جدای از تغییر تکنیک‌های انجماد، افزودن سیگنال بقای سلول، مانند میریستین (مهارکننده پروتئین کیناز 4 فعال شده با میتوژن MKK4) در کشت پس از ذوب سلول‌های کبدی منجمد شده، هم به بقای سلول در شرایط آزمایشگاهی و هم پس از پیوند در موش‌های دارای نقص ایمنی کمک می‌کند.

عوامل جدید برای بهبود بازیابی سلول‌ها پس از فریز

تلاش زیادی برای حفظ عملکرد و زنده­مانی سلول در طول فرآیند انجماد انجام می‌شود زیرا هر مرحله، جداسازی سلولی اولیه، خالص‌سازی اولیه، کشت، انتخاب CPA و نرخ‌های انجماد و ذوب پتانسیل آسیب­ رساندن به سلول‌ها و کاهش عملکرد کلی سلول را به همراه دارد. علی‌رغم این تلاش‌ها، سلول‌های انجماد شده همواره کاهش قابلیت زنده ­مانی پس از ذوب را تجربه می‌کنند.

استراتژی‌های فعلی برای شناسایی سلول‌هایی که پس از نگهداری زنده می‌مانند، استفاده از فلوروفورهای آلی و رنگ‌ها است. و همانطور که قبلاً بحث شد، گرادیان­های چگالی را می­توان برای افزایش تراکم سلول زنده استفاده کرد، اگرچه این روش اغلب شامل قراردادن سلول­ها در معرض سانتریفیوژ اضافی و بالقوه مضر است. روش‌های درگیرتر برای جداسازی سلول‌های زنده و مرده شامل جداسازی سلول‌های میل مغناطیسی (MACS) و مرتب‌سازی سلولی فعال شده با فلورسانس (FACS) است، اگرچه هزینه و عملی بودن گاهی اوقات کاربرد آنها را محدود می‌کند.

حوزه نوظهور علم نانو می‌تواند با ارائه روش‌های جایگزین غیرمخرب طبقه‌بندی سلولی و تصویربرداری سلول‌های زنده، گام بعدی را در کرایوبیولوژی ارائه کند. یک مطالعه اخیر از نانوذرات مغناطیسی کونژوگه با انکسین V برای غنی‌سازی محتوای اسپرم زنده در مایع منی گراز از طریق اتصال انتخابی به فسفاتیدیل­سرین موجود در سلول‌های آپوپتوز استفاده کرد. این طرح مرتب‌سازی می‌تواند به‌عنوان یک جایگزین ساده با توان بالا برای غنی‌سازی زنده‌مانی سلول‌های پس از ذوب در مجموعه‌ای از انواع سلول‌ها مورد استفاده قرار گیرد.

نتیجه­ گیری

پیشرفت‌های قابل توجهی در درک ما از اصول و تکنیک‌های انجماد برای ذخیره‌سازی طولانی‌مدت و انجماد سلول‌ها از اواخر دهه 1800، زمانی که تحقیقات در مورد تأثیر انجماد بر بافت زنده برای اولین بار آغاز شد، ایجاد شد. ذخیره­سازی طولانی مدت سلول­ها در دمای 196- درجه سانتیگراد متابولیسم سلولی را متوقف می­کند که منجر به تغییرات اجتناب­ناپذیر در لیپیدها و پروتئین­ها می‌شود که می­تواند عملکرد و ساختار سلول را مختل کند.

در حالت ایده‌آل، غلظت بالاتر CPA می‌تواند به سلول‌ها اجازه دهد تا به خوبی حفظ شوند. با این حال، افزایش غلظت CPA ها نیز می­تواند به سلول­ها آسیب برساند. DMSO یک CPA استاندارد طلایی برای بسیاری از انواع مختلف سلول باقی مانده است. تکنیک‌های جدید مانند ترکیبی از CPA ها یا استفاده از CPA های جدید برای رسیدگی به اثر سمیت برخی از عوامل شناخته شده بررسی شده است.

علاوه بر این، کپسوله‌سازی آلژینات سلول‌ها قبل از انجماد نشان داده است که بازده حفظ را از طریق روش‌های غیرشیمیایی بهبود می‌بخشد. صرف نظر از نوع سلول، موفقیت هر پروتکل انجماد با انتخاب دقیق چند متغیر متداول تعیین می­شود: نوع عامل محافظت کننده در برابر سرما شامل عوامل نفوذکننده و غیرنفوذکننده یا ترکیبی از هر دو، و همچنین سرعت کاهش دما و ذوب مناسب.

رویکردهای جدیدتر مانند کپسوله‌سازی آلژینات و مرتب‌سازی سلولی مبتنی بر فناوری نانو ممکن است قابلیت زنده­مانی پس از انجماد را افزایش دهد و در نهایت می‌تواند به بخشی از محیط استاندارد انجماد تبدیل شود. درک اصول شیمی و بیولوژی فرآیندهای انجماد و ذوب می‌تواند به توسعه روش‌های کارآمدتر برای حفظ انجماد سلول‌ها اجازه دهد و کاربردهای بالینی آن‌ها را بیشتر گسترش ­دهد.

 

https://journals.sagepub.com/doi/full/10.1177/0963689721999617