سیستم بافر TE (Tris-EDTA) از Tris و EDTA تشکیل شده است و نقش مهمی در استخراج DNA برای حل کردن رسوب DNA دارد.

بافر بیولوژیکی یک ترکیب  آلی است که pH واکنش را ثابت نگه می‌دارد و بنابراین از مولکول زیستی محافظت می‌کند.

DNA یکی از این نوع مولکول‌های زیستی است که از قند، فسفات و بازهای نیتروژنی تشکیل شده است. معمولاً به‌عنوان اسید نوکلئیک شناخته می‌شود؛ سایر اسیدهای نوکلئیک غیر از DNA و RNA ، به‌وفور در طبیعت وجود ندارد.

برای بررسی DNA یا  RNA، باید آن را جدا کنیم. در طول جداسازی، یک سیستم بافر مناسب برای حفظ pH واکنش و محافظت از اسید نوکلئیک مورد نیاز است.

سیستم بافر TE نوعی سیستم بافر بیولوژیکی است که به وفور در استخراج DNA و سایر مطالعات مرتبط با DNA استفاده می‌شود.

در اینجا در مقاله حاضر، عملکرد، دستورالعمل و کاربردهای بافر TE در هنگام استخراج DNA را برای شما توضیح خواهم داد.

جمع بندی سریع:

بافر TE چیست:

استخراج DNA به یک سیستم بافر تخصصی برای محافظت از DNA در برابر تخریب شیمیایی مضر نیاز دارد. یکی از این بافرها سیستم بافر TE (Tris-EDTA) است.

پروتکل‌های معمول استخراج DNA ، خروجی را به صورت رسوب ارائه می‌دهند که ناخالص و به شکل جامد است و بنابراین نمی‌توان از آن برای کاربردهای آتی استفاده کرد. برای استفاده بیشتر به یک محلول DNA خالص نیاز داریم.

به طور جداگانه، Tris و EDTA در سراسر پروتکل استخراج DNA، به عنوان اجزای بافر لیز کننده، بافر الوشن و بافر شست‌وشودهنده استفاده می‌شوند و به دستیابی به هدف نهایی ما که به دست آوردن DNA خالص است کمک می‌کنند.

تریس

تریس یک (هیدروکسی متیل) آمینو متان با فرمول مولکولی (HOCH₂)₃CNH₂ است. نقش اصلی تریس در هر عمل بیولوژیکی حفظ pH محلول و افزایش نفوذپذیری دیواره سلولی است.

تریس در بیوشیمی، زیست شناسی مولکولی و شیمی استفاده می‌شود. مقدار pKa آن  8.07 (در دمای 25 درجه سانتیگراد) است. تریس به شکل پودر و محلول در pH بین  7.0 و 9.0 موجود است.

EDTA

EDTA- اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) کاربردهای گسترده‌ای در داروها، صنایع، آزمایشگاه‌ها و لوازم آرایشی دارد.

این یک مولکول بی رنگ (سفید در صورت  پودر بودن)، محلول در آب و آلی است. با این حال، می‌توان آن را در آب با pH بالا حل کرد.

فرمول شیمیایی آن،C10H16N2O8 است. ساختار EDTA در شکل زیر نشان داده شده است. EDTA به عنوان یک عامل کلات کننده در استخراج DNA عمل می‌کند.

EDTA  یون‌های فلزی موجود در آنزیم‌ها را کلات می‌کند، یون‌های فلزی به عنوان یک کوفاکتور برای افزایش فعالیت‌های کاتالیزوری آنزیم عمل می‌کنند.

در استخراج DNA یا RNA، استفاده از EDTA به راحتی آنزیم‌های DNase یا RNase را که به ترتیب DNA یا RNA را هضم می‌کنند، غیرفعال می‌کند. در ادامه، کلاتاسیون فعالیت‌های DNase و RNase را کاهش می‌دهد.

نحوه تهیه بافر TE:

دستور تهیه محلول استوک 100 میلی لیتری TE. 10X

100 میلی‌مولار تریس هیدروکلراید: 1.57 گرم

10 میلی‌مولار EDTA: 0.292 گرم

1.57 گرم پودر تریس و 0.3722 گرم EDTA را در فلاسک وزن کنید.

98.1 میلی‌لیتر D/W اضافه کنید

pH را با استفاده از HCl تنظیم کنید و بنابراین فقط نصف مقدار D/W را اضافه کنید و pH محلول را با HCl تنظیم کنید تا PH به نزدیکی 8.0 برسد.

حجم نهایی بافر را با استفاده از D/W به  100 میلی لیتر برسانید.

در تهیه بافر TE، عامل pH نقش مهمی در انجام عملکرد مناسب دارد.

دستورالعمل برای TE. 1X

محلول استوک ما 10X است که به این معنی است که غلظت کل محلول استوک 10 برابر بیشتر از محلولی است که بر روی آن کار می‌کنیم.

از این رو برای تهیه بافر TE. 10X، باید 1 میلی لیتر بافر استوک برداریم و 9 میلی لیتر D/W به آن اضافه کنیم.

این یکی از راه حل‌های موجود است.

یا

10 میلی‌مولار Tris HCl و 1 میلی‌مولار EDTA مستقیماً  محلول1X را می‌سازند.

به منظور دستیابی به نتایج با کیفیت خوب، لطفاً محلول بافر TE را قبل از استفاده اتوکلاو کنید.

به همین ترتیب، می‌توانید یک بافر TE 2X یا 0.5X بر اساس نیاز، تهیه کنید.

اهمیت بافر Tris EDTA (TE)

همان‌طور که قبلاً گفتیم، بافر TE نقش مهمی در شستشو و جداسازی DNA دارد.

DNA یا RNA را حل می‌کند و از اسید نوکلئیک در برابر تخریب محافظت می‌کند.

این ماده اصلی تشکیل دهنده بافر استخراج DNA است که به لیز کردن دیواره سلولی و غشای هسته کمک می‌کند.

هم چنین از DNA یا RNA در برابر اثر  DNase یا RNase محافظت می‌کند.

تریس و EDTA از ترکیبات مهم بافر الکتروفورز ژل هستند و در تهیه بافر TBE و TAE استفاده می‌شوند. باز هم در طول الکتروفورز، بافر حاضر در  ژل، pH محیط را حفظ می‌کند.

علاوه بر این، بافر TE در احیای پرایمرهای DNA استفاده می‌شود.

بافر TE یک نگهدارنده DNA است که DNA را به صورت دست نخورده برای مدت طولانی تری بدون تخریب آن ذخیره می‌کند.

از آنجایی که بافر TE از تخریب DNA جلوگیری می‌کند، می‌توان از آن به عنوان نگهدارنده DNA نیز استفاده کرد که پتانسیل ذخیره DNA را برای مدت زمان طولانی تری دارد.

آیا می‌دانید؟

آب یکی دیگر از موادی است که می‌تواند DNA را به طور مؤثر حل کند، با این حال، آب هیدرولیز اسیدی را تقویت می‌کند (آب کمی اسیدی است) و بنابراین نمی‌توان برای ذخیره طولانی مدت DNA از آن استفاده کرد.

Low TE یا TE low EDTA :

بافر Low TE که به عنوان بافر TE low EDTA نیز شناخته می‌شود دارای ارزش قابل توجهی در تجزیه و تحلیل پزشکی قانونی و نقشه برداری STR دارد. حتماً برایتان جای سؤال است که Low TE چیست؟

یک نسخه تخصصی از بافر TE با کیفیت بالا با غلظت EDTA کم است که برای پردازش‌های پایین‌دستی حیاتی مانند تجزیه و تحلیل DNA پزشکی قانونی استفاده می‌شود. تریس به راحتی pH را حفظ می‌کند در حالی که EDTA یون‌ها را کلات می‌کند.

تحت غلظت بالای EDTA، آنزیم  Taq DNA polymerase نمی‌تواند به طور مؤثر کار کند زیرا به یون‌های Mg2+ به عنوان یک کوفاکتور نیاز دارد. زیرا EDTA ، Mg2+را کلات می‌کند و کارایی Taq DNA polymerase را کاهش می‌دهد.

Taq DNA پلیمراز آنزیمی است که سنتز DNA را به طور مصنوعی کنترل می‌کند و بنابراین برای تجزیه و تحلیل PCR مهم است. برای غلبه بر این مشکل، باید از TE با غلظت EDTA کم استفاده کنیم که به بافر Low TE یا TE low EDTA معروف است.

به طور کلی برای TE پایین، دو برابر حجم کمتری از EDTA برای آماده سازی بافر استفاده می‌شود. در اینجا مقایسه‌ای بین بافر معمولی و low TE وجود دارد.

تهیه بافر  low TE:

10 میلی‌مولار Tris و 0.1 میلی‌مولار EDTA در D/W حل می‌شوند تا PH به 8.0 برسد.

توجه داشته باشید که غلظت Tris-HCl را تغییر ندهید زیرا تنظیم pH محیط واکنش و محافظت از DNA مهم است.

نتیجه‌گیری

Tris و EDTA دو ماده شیمیایی مهمی هستند که در استخراج DNA به عنوان یک بافر استخراج، بافر الوشن و به عنوان بافر ذخیره استفاده می‌شوند.

آب، جایگزینی برای حل کردن DNA است. با این حال، نمی‌توان از آن برای ذخیره DNA برای استفاده طولانی مدت استفاده کرد. با این حال، اگر می‌خواهید DNA را در آب حل کنید، از آب Milli Q یا DD/W استفاده کنید. به یاد داشته باشید، از آب لوله کشی استفاده نکنید.

نکات: برای مصرف کوتاه مدت یا یکبار مصرف، DNA را در آب حل کنید، به دلیل اسیدیته خفیف آب، DNA به سرعت و به راحتی حل می‌شود.

جهت خرید و یا استعلام قیمت با ما تماس بگیرید یا در واتسپ پیام بزارید

02186073470

منبع:

مترجم:مریم محجوب

همچنین اخبار علمی را مطالعه فرمایید