سمیت سنجی داربست به روش MTT
تکنیک MTT برای محاسبه زنده مانی سلول ها در اثر سمیت یک دارو، روشی بسیار کارآمد و اولیه در سیستم های IN-VITRO می باشد. این روش در ابتدا با هدف بررسی سمیت دارو های ضد سرطان توسعه داده شد. بعد ها محققان متوجه شدند از این روش می توانند برای بررسی افزایش رشد و همچنین اثبات عدم سمیت تمامی موادی که با انسان ارتباط دارند، استفاده کرده و نتایج آن را به سیستم های IN-VIVO تعمیم دهند.
یکی از کاربرد های اضافه شده به همین تست، استفاده از آن در اثبات عدم کشندگی داربست های زیستی که در بدن یک موجود زنده ایمپلنت می شوند، می باشد.
مکانیسم عمل MTT
ترکیب MTT با عنوان دی متیل تیازول دی فنیل تترازولیوم بروماید به عنوان یک مولکول بزرگ، به شکل گسترده در بررسی زنده مانی سلول های تحت کشت استفاده می شود. این ترکیب با داشتن یک حلقه تترازولیوم، در حالت محلول و با حضور یون بروم، به داخل سلول ها نفوذ کرده و متابولیزه می شود.
آنزیم های ردوکتاز داخل سلولی با استفاده از NADH تولید شده از متابولیسم، این ترکیب را کاهش داده و یک پروتئین به یکی از گروه های آمین تترازولیوم اضافه می کنند. این امر باعث شکسته شدن حلقه تترازولیوم و خطی شدن آن می شود. با شکسته شدن، ترکیب MTT رسوب کرده و با تغییر رنگ از زرد به آبی تیره تبدیل به بلوری تحت عنوان فورمازان می شود.
بلور فورمازان زمانی که به شکل محلول در آید می تواند در طول موج های 510 و 570 نانومتر جذب نوری داشته و پیک دهد. بنابراین می توان گفت جذب نوری بالا نشان دهنده کاهش بیشتر ترکیب MTT، کاهش بیشتر این ترکیب نشان دهنده NADH بالای سلولی و بالا بودن میزان NADH حاکی از زنده بودن تعداد بیشتری از سلول ها می باشد.
کاربرد های تکنیک سمیت سنجی به روش MTT
در ابتدا با کشف ترکیب MTT، این ترکیب بیشتر در تأثیر دارو های ضد سرطان بر سلول های سرطانی بوده است. همانطور که مشخص است اولین جبهه‌ی جنگ با سلول های سرطانی، کشتن آن ها به روش آپوپتوز می باشد.
اما بعد ها کم کم این تکنیک برای تست دارو های دیگر نیز رواج یافت. به عبارتی امروزه هر ترکیب یا محصول جدیدی که ساخته می شود و هدف از ساخت آن ارتباط مستقیم با انسان خواهد بود، حتی اگر ربطی به سرطان نداشته باشد، با روش های سمیت سنجی از جمله روش MTT سمیت آن ترکیب بر سلول های مختلف انسانی و حیوانی بررسی می شود.
داربست های تولید شده برای مهندسی بافت نیز از این قائده مستثنی نیستند. لذا تمامی داربست ها نیز با روش سمیت سنجی داربست ها مورد مطالعه قرار می گیرند. در روش سمیت سنجی داربست مورد نظر به شکل مستقیم و غیر مستقیم در معرض سلول ها قرار گرفته و سمیت آن ها مورد مطالعه قرار می گیرد.
سمیت سنجی داربست ها به روش MTT
سمیت سنجی داربست ها به روش MTT در دو روش مستقیم و غیرمستقیم انجام می شود. در روش مستقیم سمیت سنجی داربست به شکل مستقیم در معرض سلول ها قرار گرفته و سپس زنده مانی سلولی مورد بررسی قرار می گیرد. در روش غیرمستقیم سمیت سنجی داربست در مجاورت محیط کشت کامل قرار گرفته و سپس آن محیط کشت به سلول های کاشته شده اضافه می شود.
در روش مستقیم، ابتدا داربست های مورد نظر به خوبی استریل شده و در کف پلیت قرار می گیرند. در این روش سمیت سنجی داربست ها هرچقدر کوچک تر طراحی شوند، بهتر است. چرا که این تست در پلیت های چندخانه مختلف از 6 تا 96 خانه قابل انجام است و هرچقدر ابعاد چاهک های مورد استفاده کوچک تر باشد، تست با خطای کمتری انجام می شود.
در روش سمیت سنجی مستقیم، باید توجه داشت که اگر داربست خود به تنهایی خاصیت احیاء کنندگی داشته باشد، می تواند بر روی MTT تأثیر گذاشته، موجب احیای آن و تولید فورمازان کاذب شود. این تست به شکل استاندارد در 5 تکرار و روز های 1، 3 و 5 مورد مطالعه قرار می گیرد. در روش سمیت سنجی داربست به روش مستقیم، دو سری چاهک 5 تکرار با عناوین CONTROL و BLANK کاشته می شوند.
چاهک های کنترل شامل چاهک هایی هستند که محیط کشت کامل به همراه سلول ها را دریافت کرده و هیچ تیماری روی آن ها انجام نمی شود. همچنین چاهک های بلنک فقط محیط کشت بدون سلول را دریافت کرده و تیماری نیز روی آن ها انجام نمی شود.
در روش غیر مستقیم سمیت سنجی داربست، سلول ها در یک پلیت 96 خانه کاشته شده و مجزا در ظرف استریل دیگری که هیچ سمیتی ندارد، از داربست ها عصاره گیری می شود. یعنی به عبارتی در روز منفی 1 همزمان با کاشت سلول ها در پلیت 96 خانه به شکل 5 تکرار به ازای هر داربست، داربست ها در همان روز در محیط کشت کامل قرار گرفته و به مدت 24 ساعت در انکوباتور کشت سلولی انکوبه می شوند.
مقدار داربست مورد استفاده در عصاره گیری سمیت سنجی داربست ها، 5 الی 100 میلی‌گرم به ازای هر 1 میلی‌لیتر محیط کشت می باشد. تصمیم گیری برای مقدار داربست قرار داده شده در محیط کشت برای سمیت سنجی داربست، بستگی به نوع و ساختار آن دارد. عموماً داربست های طبیعی آسلولار شده را در همان مقدار 100 میلی‌گرم برای هر 1 میلی‌لیتر محیط کشت در نظر می گیرند.
در روش سمیت سنجی داربست به روش غیر مستقیم، دو سری چاهک 5 تکرار با عناوین CONTROL و BLANK کاشته می شوند. چاهک های کنترل شامل چاهک هایی هستند که محیط کشت کامل به همراه سلول ها را دریافت کرده و هیچ تیماری روی آن ها انجام نمی شود. همچنین چاهک های بلنک فقط محیط کشت بدون سلول را دریافت کرده و تیماری نیز روی آن ها انجام نمی شود.
همچنین در روش سمیت سنجی داربست ها به روش غیرمستقیم، دو سری چاهک 5 تکرار با عناوین کنترل مثبت و کنترل منفی در نظر گرفته می شوند. کنترل مثبت شامل چاهک هایی هستند که محیط کشت به همراه سلول را دریافت کرده و با عصاره کشنده مانند عصاره لاتکس یا گرانول های صنعتی تیمار می شوند. کنترل منفی نیز شامل چاهک هایی هستند که محیط کشت به همراه سلول را دریافت کرده و با عصاره غیرسمی مانند عصاره فلاسک کشت سلولی یا گرانول های پزشکی تیمار می شوند.
مطالب مرتبط:
- انواع کشت ۳ بعدی و مهندسی بافت
- پزشکی بازساختی و کاربرد های آن
- داربست آسلولار چیست؟ روش تولید داربست آسلولار
نویسنده: مسعود سلطانی حلوائی
