انواع استخراج DNA

در دنیای امروز تجزیه و تحلیل DNA با روش PCR چند زمانه و زمان واقعی، اهمیت DNA خالص و با کیفیت بالا را نمیتوان دست کم گرفت. یافتن یک سیستم جداسازی DNA مناسب برای برآوردن نیازهای شما برای تکمیل موفقیت آمیز آزمایش‌ها حیاتی است.

یکی از مهمترین موارد در تعیین مولکولی عوامل بیماری زای منتقل شده از طریق غذا، DNA ژنومی با کیفیت بالا است. نمونه‌های خونی یکی از منابع اصلی مورد استفاده برای بدست آوردن DNA هستند و پروتکلهای مختلفی برای انجام استخراج اسید نوکلئیک در نمونه‌های موجود وجود دارد. این روشها از پروتکلهای دستی بسیار اساسی تا روشهای پیچیده‌تر موجود در پروتکلهای استخراج DNA خودکار متفاوت است. با توجه به طیف گسترده‌ای از گزینه‌های موجود، بهتر است گزینه‌هایی را که از نظر مقرون به صرفه بودن و کارایی زمان بهترین عملکرد را دارند، تعیین کنید. ما سابقه استخراج DNA و متداول ترین روشهای استخراج DNA از نمونه‌های خون کامل را مرور کرده ایم و مزایا و معایب فردی آنها را برجسته کرده‌ایم. ما همچنین ادبیات علمی فعلی را برای یافتن مطالعاتی در مقایسه روشهای مختلف استخراج اسید نوکلئیک، برای تعیین بهترین انتخاب موجود جستجو کردیم. بر اساس تحقیقات ما، ما مشخص کردیم که شواهد علمی کافی برای پشتیبانی از یک روش استخراج DNA خاص از نمونه‌های کامل خون وجود ندارد. انتخاب یک روش مناسب هنوز یک فرایند است که نیاز به در نظر گرفتن عوامل مختلف دارد و تحقیقات بیشتری برای تأیید انتخابهای انجام شده در تأسیسات سراسر جهان مورد نیاز است.

Friedrich Miescherاولین دانشمندی بود که DNA را هنگام مطالعه ترکیب شیمیایی سلولها جدا کرد. در سال 1869 ، او از لکوسیتهایی( گلبول سفید) که از نمونه‌ها روی باندهای جراحی جدید جمع آوری کرده بود استفاده کرد و آزمایشهایی را برای تصفیه و طبقه بندی پروتئینهای موجود در این سلولها انجام داد. در طی آزمایشات خود، او ماده جدیدی را در هسته‌ها شناسایی کرد که آن را “نوکلئین” نامید. مواد سلولی این یافته علمی، همراه با پروتکلهای جداسازی مورد استفاده، در سال 1871 با همکاری مربی وی، Felix Hoppe-Seylerمنتشر شد، اما فقط در سال 1958 بود که Meselson وStahlیک روش آزمایشگاهی معمول برای استخراج DNA ایجاد کردند به آنها با استفاده از پروتکل سانتریفیوژ گرادیان چگالی نمک، استخراج DNA از نمونه‌های باکتریایی اشرشیاکلی را انجام دادند. از آن زمان، تکنیکهای استخراج DNA برای انجام استخراج در انواع مختلف منابع بیولوژیکی مناسب است.

روشهای استخراج DNA از برخی روشهای رایج برای دستیابی به اختلال موثر سلولها، تغییر رنگ کمپلکسهای نوکلئوپروتئینی، غیرفعال سازی نوکلئازها و دیگر آنزیمها، حذف آلاینده‌های بیولوژیکی و شیمیایی و در نهایت بارش DNA پیروی میکند. استفاده از معرفهای آلی و غیر ارگانیک و روشهای سانتریفیوژ. در نهایت، آنها به انواع روشهای خودکار و کیت‌های تجاری موجود تبدیل شده‌اند.

لیز سلولها یک گام رایج در اکثر پروتکلهای استخراج DNA است و معمولاً با استفاده از مواد شوینده و آنزیمها به دست می‌آید. سدیم دودسیل سولفات (SDS) و Triton ™ X-100 (Sigma-Aldrich، St Louis، MO، USA) نمونه‌هایی از شوینده‌های محبوب هستند که برای حل شدن غشای سلولی مورد استفاده قرار میگیرند. آنزیمها همچنین با مواد شوینده ترکیب میشوند تا سطح سلول یا اجزای سیتوزولی را هدف قرار دهند. پروتئیناز K یک آنزیم متداول است که در پروتکلهای مختلف برای برش گلیکوپروتئینها و غیرفعال کردن RNases و DNases استفاده میشود. سایر مواد خنثی کننده مانند اوره، نمکهای گوانیدینیوم و شاتروپهای شیمیایی نیز برای ایجاد اختلال در سلولها و غیرفعال کردن آنزیمهای سلولی استفاده شده‌اند، اما اینها میتوانند بر کیفیت و عملکرد اسید نوکلئیک تأثیر بگذارند.

بارش DNA با افزودن غلظت بالای نمک به محلولهای حاوی DNA به دست می‌آید، زیرا کاتیونهای نمکهایی مانند استون آمونیوم با دافعه ناشی از بار منفی ستون فقرات فسفات مقابله میکند. مخلوطی از DNA و نمکها در حضور حلال‌هایی مانند اتانول (غلظت نهایی 70 تا 80 درصد) یا ایزوپروپانول (غلظت نهایی 40 تا 50 درصد) باعث رسوب اسیدهای نوکلئیک میشود. برخی پروتکلها شامل مراحل شستشو با 70٪ اتانول برای حذف نمک اضافی از DNA است. در نهایت، اسیدهای نوکلئیک در آب یا بافر TE مجدداً معلق میشوند.

بافر 7-9 TE معمولاً برای ذخیره سازی طولانی مدت DNA استفاده میشود زیرا مانع از آسیب رساندن آن به نوکلئازها، pH نامناسب، فلزات سنگین و اکسیداسیون توسط رادیکالهای آزاد میشود. pH Tris ایمن 7-8 را ارائه میدهد و EDTA یونهای دو ظرفیتی را که در فعالیت نوکلئاز مورد استفاده قرار میگیرد، کلات میکند( نگه‌میدارد) و با آسیب اکسیداتیو فلزات سنگین مقابله میکند.

پروتکل های مبتنی بر محلول دارای دو رویکرد اصلی هستند:

1) روشهای مبتنی بر محلول با استفاده از حلالهای آلی.

2) روشهای مبتنی بر روش نمک زدایی.

روشهای مبتنی بر محلول با استفاده از حلالهای آلی

پروتکلهای استخراج DNA با استفاده از حلالهای آلی که در اصل از یک سری روشهای مربوط به استخراج RNA تهیه شده است. برخی از مراحل اصلی مورد استفاده در این روشها عبارتند از:

1) لیز سلولی با افزودن محلول حاوی مواد شوینده/چائوتروپیک ، از جمله سارکوزین SDS یا N-Lauroyl .

2) غیر فعال شدن DNases و RNases ، معمولاً از طریق استفاده از حلالهای آلی .

3) تصفیه DNA و حذف RNA ، لیپیدها و پروتئین ها.

4) احیای اسیدهای نوکلئیک استخراج شده.

از آنجا که این تکنیکها شامل استفاده از حلالهای آلی سمی و خورنده است، ایمنی نگرانی اصلی است. تجهیزات حفاظتی شخصی، اقدامات ایمنی شامل استفاده از هود زیستی و آموزش لازم است. فنل -کلروفرم باید با pH مناسب تعادل داشته باشد و شرایط پروتکل باید بهینه شود. در تلاش برای افزایش ایمنی و سهولت استفاده از این پروتکلها، تغییرات خاصی به منظور جلوگیری از تماس فیزیکی با حلالها ارائه شده است. اینها شامل ترکیب پلیمر ژل سیلیکا 16 یا جایگزینی حلالها با مواد دیگر مانند بنزیل الکل است.

روشهای استخراج DNA مبتنی بر محلول با استفاده از نمک زدایی

برخی از تکنیکهای استخراج اسید نوکلئیک که از استفاده از حلالهای آلی اجتناب میکنند نیز در طول سالها توسعه یافته است. در سال 1988، Miller و همکاران پروتکلی را منتشر کردند که به تصفیه DNA از طریق رسوب پروتئین در غلظت بالای نمک دست یافت. پروتکل سنتی شامل اختلال و هضم اولیه سلول با SDS -پروتئیناز K و به دنبال آن افزودن غلظتهای بالایی از نمکها، معمولاً 6M کلرید سدیم است. سپس مخلوط سانتریفیوژ میشود تا پروتئینها به ته رسوب کنند و مایع رویی حاوی DNA سپس به یک ویال جدید منتقل میشود. سپس DNA با استفاده از اتانول یا ایزوپروپانول رسوب میکند.

روشهای استخراج DNA فاز جامد

تصفیه DNA با استفاده از روش مایع/فاز جامد را می توان در سال 1979 مشاهده کرد، زمانی که محققان از سیلیس به شکل پودر شیشه در پروتکل خود برای تصفیه قطعات DNA که قبلاً با الکتروفورز ژل آگارز جدا شده بودند، استفاده کردند. روشهای استخراج فاز جامد برای استخراج DNA از نمونه‌های خون در ابتدا در سال 1989 توصیف شد که تکنیکی را با استفاده از ذرات نامحلول بر پایه سیلیس منتشر کرد که از نظر شیمیایی شبیه به فنول است و با پروتئینها تداخل میکند تا امکان تصفیه DNA فراهم شود. تعدادی از روشهای مختلف با استفاده از روش استخراج DNA مایع/جامد از آن زمان توسعه یافته است و در اکثر کیتهای استخراج تجاری موجود استفاده میشود.

این تکنیک‌ها DNA را تحت شرایط خاص pH و میزان نمک از طریق هر یک از اصول زیر جذب میکنند:

1) اتصال هیدروژن در حضور عامل کائوتروپیک به ماتریس آب دوست.

2) تبادل یونی با استفاده از مبدل آنیونی در شرایط آبی.

  اکثر این روشها مجموعه‌ای از مراحل مشابه را برای دستیابی به اختلال سلولی، جذب DNA ، شستشوی اسید نوکلئیک و شستشوی نهایی دنبال میکنند. اکثر تکنیکهای فاز جامد از ستون اسپین برای اتصال اسید نوکلئیک تحت نیروی گریز از مرکز استفاده میکنند. ستون‌های اسپین از ماتریس‌های سیلیس، ذرات یا پودر شیشه، خاک دیاتومه یا حاملهای تبادل آنیون ساخته شده‌اند و این ترکیبات عموماً باید با استفاده از محلولهای بافر در PH خاص تهویه شوند تا به شکل شیمیایی مورد نیاز تبدیل شوند. سلولهای خونی که قبلاً با استفاده از بافرهای مخصوص لیز تخریب شده‌اند، روی ستونها اعمال شده و سانتریفیوژ میشوند و DNA با کمک شرایط pH و غلظت نمک که توسط محلولهای اتصال ایجاد میشود، به ستون متصل میشود. برخی از پروتئینها و سایر ترکیبات بیوشیمیایی نیز ممکن است به ستون متصل شوند و بعداً با استفاده از بافرهای شستشو حاوی عوامل رقابتی طی یک سری مراحل شستشو حذف میشوند. DNA در نهایت در آب مقطر استریل یا بافر TE شستشو میشود.

روشهای استخراج DNA با استفاده از ماتریس سیلیس

ماتریسهای سیلیس خواص منحصر به فردی برای اتصال به DNA دارند. آنها دارای بار مثبت هستند و تمایل زیادی به بار منفی ستون فقرات DNA دارند. شرایط نمک بالا و pH با استفاده از کاتیونهای سدیم، که محکم به اکسیژن با بار منفی در ستون فقرات DNA متصل میشوند، بدست می‌آید. آلودگی‌ها با یک سری مراحل شستشو حذف میشوند و پس از آن با استفاده از بافر TE یا آب مقطر استریل، DNA تحت استحکام یونی کم (pH -7) شسته میشود. در این پروتکلها، نمونه‌های خون برای چند دقیقه با بافر لیز انکوبه میشوند. تکمیل اکثر پروتکل‌ها حدود 40 دقیقه تا 1 ساعت طول میکشد و بازده بالایی از DNA را با حداقل آلودگی تولید میکند .

استخراج DNA با استفاده از تبادل آنیونی

مواد شیمیایی دارای بار مثبت که میتوانند به اسیدهای نوکلئیک دارای بار منفی یا آلودگی‌ها یا آنزیمهایی مانند نوکلئازها متصل شوند، رزین های تبادل آنیونی نامیده میشوند و از آنها به عنوان بخشی از پروتکلهای استخراج DNA از نمونه‌های خون نیز استفاده شده است. رزین از کوپلیمرهای استایرن دیوینیل بنزن ساخته شده است که حاوی یونهای ایمینودیاستات زوج است. از آن در پروتکلهای استخراج DNA به عنوان رزین تبادل یونی کلات کننده استفاده میشود که یونهای فلزی چند ظرفیتی مانند نوکلئازهایی را که معمولاً در استخراج DNA از نمونه‌های پزشکی قانونی مورد استفاده قرار میگیرد، متصل میکند.

روشهای استخراج DNA با استفاده از مهره‌های مغناطیسی

تکنیکهای استخراج اسید نوکلئیک با استفاده از جداسازی مغناطیسی از اوایل دهه 1990 در حال ظهور است.

ذرات مغناطیسی از یک یا چند هسته مغناطیسی مانند مگنتیت (Fe3O4) یا ماگمیت (گاما Fe2O3) ساخته شده‌اند که با ماتریسی از پلیمرها، سیلیس یا هیدروکسی آپاتیت با گروههای فعال شده پایانی پوشیده شده‌اند. در پروتکل توسعه یافته ، 42،43 30 میکرولیتر خون کامل با حجم مساوی 1٪ محلول SDS مخلوط شده است. لوله با وارونگی دو یا سه بار مخلوط شده و به مدت 1 دقیقه در دمای اتاق انکوبه میشود. ده میکرولیتر نانوذرات مغناطیسی به این مخلوط اضافه میشود و به دنبال آن 75 میکرولیتر بافر اتصال (1.25 M کلرید سدیم و 10٪ پلی اتیلن گلیکول 6000) اضافه میشود. محلول با وارونگی مخلوط شده و اجازه داده میشود به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق استراحت کند و گلوله مغناطیسی با استفاده از آهنربای خارجی برای دور ریختن مایع رویی بی‌حرکت میشود. گلوله مغناطیسی با 70 درصد اتانول شسته و خشک میشود. گلوله مغناطیسی در 50 میکرولیتر بافر TE مجدداً معلق میشود و ذرات مغناطیسی متصل به DNA با انکوباسیون در دمای 65 درجه سانتی گراد با همزن مداوم شسته میشوند.

انتخاب پروتکل مناسب

روش استخراج ایده آل باید با معیارهای زیر مطابقت داشته باشد: باید حساس، سازگار، سریع و آسان برای استفاده باشد و بسته به کشوری که در آن استفاده میشود ممکن است به حداقل رساندن تجهیزات تخصصی یا دانش بیوشیمیایی مهم باشد. همچنین باید حداقل خطر را برای کاربران ایجاد کند و همچنین از آلودگی احتمالی نمونه‌ها جلوگیری کند. سرانجام و مهمتر از همه، تکنیک استخراج DNA انتخاب شده باید بتواند نمونه‌های DNA خالص را برای استفاده در برنامه‌های مولکولی پایین دست آماده کند.

مطالعه صدها مطلب علمی در حوزه بیولوژی

آرشیو جدیدترین خبرهای روز دنیای بیولوژی

مترجم: غزل زارعی