معرفی تکنیک الایزای غیر مستقیم
الایزای غیر مستقیم یک الایزای دو مرحله‌ای است که شامل دو فرآیند اتصال آنتی‌بادی اولیه و آنتی‌بادی ثانویه نشان‌دار می‌باشد. آنتی‌بادی اولیه با آنتی‌ژن و سپس با آنتی‌بادی ثانویه، انکوبه می‌شود.
با این حال، این امر ممکن است به دلیل واکنش متقاطع که آنتی‌بادی ثانویه می‌تواند ایجاد کند، به سیگنال‌های غیر اختصاصی منجر شود. در تست الایزای غیر مستقیم، آنتی‌بادی نمونه بین آنتی‌ژن که روی پلیت (Plate) را پوشانده و یک مزدوج گلوبولین ضد گونه با برچسب آنزیمی، قرار میگیرد. افزودن یک شناساگر کروموژنیک (Chromogenic) سوبسترای آنزیمی باعث ایجاد رنگ می‌شود.
این رنگ با مقدار آنتی‌بادی نمونه متصل شده، نسبت مستقیم دارد. هر چه آنتی‌بادی در نمونه بیشتر باشد، شدت رنگ در چاهک‌های تست قوی‌تر است. این فرمت از الایزای غیر مستقیم برای تعیین سطح آنتی‌بادی کل در نمونه‌ها مناسب است.
الایزای غیر مستقیم برای تخمین کمی آنتی‌بادی‌ها در سرم و سایر مایعات بدن استفاده می‌شود. در این روش، نمونه‌ها به چاهک‌های پلیت میکروتیتر (Microtiter) پوشانده شده با آنتی‌ژن که قرار است آنتی‌بادی‌های اختصاصی روی آنها شناسایی شوند، اضافه می‌شوند. پس از یک دوره انکوباسیون، چاهک‌ها شسته می‌شوند.
اگر آنتی‌بادی در نمونه وجود داشته باشد، کمپلکس آنتی‌ژن- آنتی‌بادی تشکیل می‌شود و با شستن از بین نمی‌رود. از طرف دیگر، اگر آنتی‌بادی خاصی در نمونه وجود نداشته باشد، تشکیل کمپلکسی هم وجود نخواهد داشت. سپس یک آنتی‌بادی ضد ایزوتایپ (Anti-isotype) کونژوگه شده (Conjugated) با یک آنزیم، اضافه شده و انکوبه می‌شود. پس از یک مرحله شستشوی دیگر، یک سوبسترا برای این آنزیم اضافه می‌شود.
اگر در مرحله اولیه، تشکیل کمپلکس وجود داشته باشد، آنتی‌بادی ضد ایزوتایپ ثانویه به آنتی‌بادی اولیه متصل می‌شود و یک واکنش کروموژنیک بین آنزیم و سوبسترا وجود خواهد داشت. با اندازه‌گیری مقادیر چگالی نوری چاهک‌ها، پس از افزودن محلول متوقف کننده (Stop solution) برای توقف واکنش کروموژنیک، می‌توان مقدار کمپلکس آنتی‌ژن- آنتی‌بادی تشکیل‌شده در مرحله اول را تعیین کرد.
مراحل/ فرایند الایزای غیر مستقیم
- پلیت‌های میکروول (Micro-well plate) با آنتی‌ژن انکوبه می‌شوند، سپس شسته شده و با BSA مسدود می‌شوند.
- نمونه‌های حاوی آنتی‌بادی اضافه شده و شسته می‌شوند.
- آنتی‌بادی ثانویه متصل به آنزیم اضافه شده و شسته می‌شود.
- یک سوبسترا اضافه می‌شود و آنزیم‌های روی آنتی‌بادی یک سیگنال کروموژنیک یا فلورسنت ایجاد می‌کنند.
مزایای الایزای غیر مستقیم
- حساسیت بالا: بیش از یک آنتی‌بادی نشان‌دار شده به هر مولکول آنتی‌ژن متصل است.
- انعطاف‌پذیری: آنتی‌بادی‌های تشخیص اولیه مختلف را می‌توان با یک آنتی‌بادی ثانویه نشان‌دار منفرد استفاده کرد.
- صرفه جویی در هزینه: آنتی‌بادی‌های نشان‌دار کمتری مورد نیاز است.
پروتکل الایزای غیر مستقیم
- پلیت میکروتیتر را با آنتی‌ژن بپوشانید: 50 میکرولیتر محلول آنتی‌ژن (شناساگر پوشش) را در چاهک‌های پلیت میکروتیتر پخش کنید.
- پلیت‌های پوشش داده شده را در پوشش پلاستیکی بپیچید تا غیر قابل نفوذ گردد و سپس به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور، آنها را انکوبه کنید.
- پس از انکوباسیون، پلیت میکروتیتر را باز کرده و محلول را در یک ظرف بریزید.
- مرحله شستشو: محلول پوششی را بردارید و با پر کردن چاهک‌ها با 200 میکرولیتر PBS، پلیت را دو بار بشویید. محلول‌ها یا شستشوها با پیپت کردن (Pipetting) حذف می‌شوند. قطرات باقیمانده با کشیدن ملایم پلیت روی یک حوله کاغذی پاک می‌شوند.
- مرحله مسدود کردن: با افزودن 200 میکرولیتر بافر مسدود کننده، محل‌های اتصال پروتئین باقیمانده در چاهک‌های پوشش داده شده را مسدود کنید و 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
- محلول را دور بریزید و مرحله شستشو را انجام دهید. میکروپلیت را به آرامی روی حوله کاغذی بکشید.
- 50 میکرولیتر محلول آنتی‌بادی را با استفاده از میکروپیپت (Micropipette) از ویال به چاهک اضافه کنید.
- پلیت را در پلاستیک بپیچید و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید. مایع را دور بریزید و کف پلیت را با کاغذ جاذب خشک به آرامی پاک کنید.
- مرحله شستشو را تکرار کنید
- مرحله مسدود کردن را تکرار کنید.
- مرحله شستشو را تکرار کنید.
- 50 میکرولیتر شناساگر آنتی‌بادی ثانویه را به چاهک‌ها اضافه کنید.
- پلیت میکروتیتر را در پوشش پلاستیکی بپیچید و 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.
- مرحله شستشو را تکرار کنید.
- 75 میکرولیتر محلول سوبسترا را از ویال به چاهک‌های روی پلیت‌های میکروتیتر اضافه کنید.
- پلیت‌های میکروتیتر را در پوشش پلاستیکی بپیچید و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.
- 25 میکرولیتر محلول متوقف کننده (NaOH5 مولار) را از ویال به چاهک‌های روی پلیت‌های میکروتیتر اضافه کنید.
- جهت استفاده از یک دستگاه میکروتیتر پلیت ریدر (Micro titer plate reader) برای اندازه‌گیری هیدرولیز NPP، از یک فیلتر 405 نانومتری استفاده کنید.
همچنین بخوانید:
مترجم: صادق حسینی‌کیا
