استخراج ژنوم به روش جوشاندن: مراحل و کاربردها

مقدمه‌ای بر استخراج ژنوم به روش جوشاندن

استخراج ژنوم یک فرآیند اساسی در زیست‌شناسی مولکولی است که به محققان اجازه می‌دهد DNA یا RNA را از سلول‌ها برای کاربردهای مختلف مانند شناسایی مبتنی بر PCR، توالی‌یابی و ژنوتیپینگ جدا کنند. روش استفاده شده برای استخراج ژنوم بر اساس نوع ارگانیسم مورد مطالعه، خلوص مورد نیاز و کاربرد نهایی اسیدهای نوکلئیک استخراج شده متفاوت است. با توجه به اینکه روش‌های سنتی مانند استخراج فنل-کلروفرم، کیت‌های ستون سیلیکا و تکنیک‌های ذرات مغناطیسی DNA با خلوص بالا ارائه می‌دهند، اما اغلب زمان‌بر، گران و نیازمند مواد شیمیایی خطرناک هستند.

روش جوشاندن برای استخراج ژنوم یک جایگزین سریع، مقرون به صرفه و به‌طور گسترده استفاده شده است، به ویژه برای کاربردهای میکروبیولوژی متداول. این روش بر اساس این اصل استوار است که قرار گرفتن در دماهای بالا (95–100°C) باعث از هم پاشیدن غشای سلولی باکتریایی یا مخمر شده و منجر به آزاد شدن مواد ژنومی به محیط اطراف می‌شود. اگرچه این روش DNA با خلوص بالا ارائه نمی‌کند، اما برای PCR، RAPD-PCR  و تکنیک‌های زیست‌شناسی مولکولی پایه‌ای کافی است.

اصل روش جوشاندن

این روش بر اساس این فرضیه است که قرار دادن سلول‌های باکتریایی یا مخمر در دماهای بسیار بالا باعث از هم پاشیدن اجزای ساختاری مانند دیواره سلولی و غشا می‌شود. این اختلال منجر به آزاد شدن محتوای داخل سلولی، از جمله اسیدهای نوکلئیک، به محیط اطراف می‌شود.

فرآیند نسبتاً ساده است و شامل سانتریفوژ برای رسوب سلول‌ها، جوشاندن رسوب در یک بافر مناسب، خنک‌سازی سریع و سانتریفوژ نهایی برای حذف ضایعات سلولی است. سوپرناتانت حاوی DNA سپس با دقت جمع‌آوری می‌شود و می‌تواند مستقیماً برای کاربردهایی مانند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و الکتروفورز ژل استفاده شود.

این روش به ویژه برای باکتری‌های گرم منفی موثر است، زیرا دیواره پپتیدوگلیکان نازک آن‌ها باعث لیزسلولی آسان‌تر در معرض حرارت می‌شود.

مزایای روش جوشاندن

در مقایسه با سایر تکنیک‌های استخراج DNA، روش جوشاندن مزایای خاصی دارد:

• پردازش سریع: کل فرآیند، از کشت باکتری تا استخراج DNA، می‌تواند در عرض 15 تا 30 دقیقه انجام شود این روش برای آزمایش‌های حساس یک زمان ایده‌آل است.
• مقرون به صرفه: این روش به حداقل مواد شیمیایی (آب مقطر یا بافر) نیاز دارد و نیاز به کیت‌های استخراج DNA تجاری گران‌قیمت را از بین می‌برد.
• پروتکل ساده: برخلاف روش‌های مبتنی بر ستون یا استخراج با حلال، روش جوشاندن شامل مراحل کمتری است و به تجهیزات پیچیده نیاز ندارد.
• سازگار با dna :pcr استخراج شده به اندازه کافی برای کاربردهای مبتنی بر PCR خالص است ، از جمله شناسایی باکتریایی، ژنوتیپینگ و مطالعات مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها.
• دوستدار محیط زیست: برخلاف استخراج فنل-کلروفرم که از حلال‌های آلی خطرناک استفاده می‌کند، روش جوشاندن یک جایگزین ایمن‌تر با حداقل پسماند شیمیایی است.

با این حال، این روش محدودیت‌هایی دارد، مانند بازده کم DNA، آلودگی‌های سلولی باقیمانده و لیز سلولی ناقص برای برخی از میکروارگانیسم‌ها. همچنین این روش برای توالی‌یابی با فیدلیتی بالا، آنالیز ژنوم کامل یا کاربردهای کلونینگ مناسب نیست.

مواد و تجهیزات مورد نیاز

مواد شیمیایی

برای انجام استخراج ژنوم با استفاده از روش جوشاندن، مواد شیمیایی زیر مورد نیاز است:

• آب مقطر استریل یا بافر TE (به عنوان بافر استخراج برای حفظ پایداری DNA استفاده می‌شود)

تجهیزات آزمایشگاهی و لوازم مصرفی

• لوله‌های سانتریفوژ میکرو (1.5 یا 2.0 میلی‌لیتر، استریل( این لوله ها برای نگهداری رسوب باکتریایی و DNA استخراج شده استفاده می‌شود.
• حمام آب در حال جوش یا بلوک حرارتی (95–100°C) اطمینان از گرمایش یکنواخت برای لیزسلولی باکتریایی.
• سانتریفوژ میکرو (با توانایی حداقل 12,000 دور در دقیقه) برای رسوب سلول‌ها و جداسازی DNA از ضایعات سلولی استفاده می‌شود.
• ورتکس برای اطمینان از توزیع یکنواخت رسوب باکتریایی.
• پیپت‌ها و نوک‌های فیلتر استریل جهت جلوگیری از آلودگی در طول دستکاری نمونه.
• ظرف یخ  برای خنک‌سازی نمونه پس از جوشاندن به منظور جلوگیری از تخریب بیشتر DNA.

مراحل گام به گام برای استخراج ژنوم به روش جوشاندن

مرحله 1: آماده‌سازی نمونه

آماده‌سازی کشت باکتری:

• یک کشت باکتری یا مخمر تازه را انتخاب کنید و در محیط کشت NB یا LB در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 16 تا 24 ساعت  رشد دهید.
• برای استخراج DNA از کلنی، یک کلنی منفرد را با استفاده از یک لوپ استریل انتخاب کنید و آن را در 100 میکرولیتر آب مقطر یا بافر TE حل کنید.

جمع‌آوری سلول‌ها:

• 1 میلی‌لیتر از کشت باکتری را به یک لوله سانتریفوژ میکرو استریل 1.5 میلی‌لیتری منتقل کنید.
• در 10,000 تا 12,000 دور در دقیقه به مدت 3 تا 5 دقیقه سانتریفوژ کنید تا یک رسوب باکتریایی فشرده تشکیل شود.
• سوپرناتانت را با دقت دور بریزید و فقط رسوب را در ته لوله باقی بگذارید.

مرحله 2: لیز سلولی با جوشاندن

1. رسوب باکتریایی را در 100 تا 200 میکرولیتر آب مقطر استریل یا بافر TE حل کنید.
2. به خوبی با استفاده از ورتکس مخلوط کنید تا توزیع یکنواخت داشته باشید.
3. لوله را در یک حمام آب در حال جوش یا بلوک حرارتی در دمای 95 تا 100 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 تا 15 دقیقه قرار دهید.
4. بلافاصله لوله را به یک سبد یخ منتقل کنید تا به سرعت خنک شود (5 دقیقه) و پروتئین‌ها رسوب کنند و تخریب DNA به حداقل برسد.

مرحله 3: بازیابی و خلوص‌سازی DNA

1. نمونه جوشانده را در 12,000 دور در دقیقه به مدت 5 تا 10 دقیقه سانتریفوژ کنید تا DNA را از ضایعات سلولی جدا کنید.
2. سوپرناتانت شفاف که حاوی DNA ژنومی است را با دقت به یک لوله سانتریفوژ میکرو استریل جدید منتقل کنید.
3. DNA استخراج شده را می‌توان در دمای منفی 20 درجه سانتی‌گراد ذخیره کرد یا مستقیماً برای آزمایش‌های مولکولی استفاده کرد.

مراحل اختیاری برای بهبود بازده DNA

• برای باکتری‌های گرم مثبت، قبل از جوشاندن 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر لیزوزیم یا لیزوستافین اضافه کنید تا هضم پپتیدوگلیکان را تسهیل کنید.
• برای نمونه‌های قارچی، زیمولایز یا بتا-گلوکاناز را قبل از جوشاندن اضافه کنید.
• اگر آلودگی پروتئینی مشکل ساز است است، تیمار با پروتئیناز K  (20 µg/mL) ، 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه قبل از جوشاندن می‌تواند خلوص را بهبود بخشد.

کاربردهای روش جوشاندن

• شناسایی باکتری مبتنی بر PCR :DNA  استخراج شده مستقیماً برای توالی‌یابی  16S rRNA و شناسایی در سطح گونه قابل استفاده است.
• ژنوتیپینگ و آزمایش مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها: در تیپینگ توالی چندلوکوس (MLST) و غربالگری ژن‌های آنتی‌بیوتیکی استفاده می‌شود.
• میکروبیولوژی مواد غذایی و آب: تشخیص سریع پاتوژن‌ها در نمونه‌های آلوده.
• میکروبیولوژی دامپزشکی و بالینی: در آزمایشگاه‌های تشخیص میکروبیولوژی برای تشخیص عفونت‌های باکتریایی شایع استفاده می‌شود.

محدودیت‌های روش جوشاندن

• خلوص کم DNA: مناسب برای توالی‌یابی با فیدلیتی بالا، آنالیز ژنوم کامل یا کاربردهای کلونینگ نیست.
• بازده متغیر: غلظت و کیفیت DNA ممکن است بسته به ارگانیسم متفاوت باشد.
• لیزسلولی ناقص: نیاز به پیش‌درمانی آنزیمی برای باکتری‌های گرم مثبت و قارچ‌ها دارد.

نتیجه‌گیری

روش جوشاندن برای استخراج ژنوم یک تکنیک کارآمد، سریع و مقرون به صرفه است که برای کاربردهای متداول مبتنی بر PCR مناسب است. اگرچه این روش DNA با خلوص بالا ارائه نمی‌کند، اما سادگی و هزینه کم مواد شیمیایی آن را به یک گزینه جذاب برای آزمایشگاه‌هایی که وظیفه شناسایی باکتریایی یا قارچی در مقیاس بزرگ را دارند تبدیل می‌کند.

همچنین بخوانید: