آنالایزر DNA: اصول کار، مراحل کار و موارد استفاده

آنالایزر DNA چیست؟ مقدمه‌ای بر آنالایزر ژنتیکی

فناوری مولکولی یکی از برجسته‌ترین تکنیک‌های مورد استفاده در زیست‌شناسی مدرن است. بسیاری از تکنیک‌های ژنتیکی دائماً به آنالیز DNA نیاز دارند، در نتیجه این آنالیز هنگامی که به صورت دستی انجام شود، خسته کننده می‌باشد.

آنالایزر DNA، آنالایزر ژنوم، آنالیزگر ژنتیکی یا توالی‌سنج DNA، تجهیزات خودکاری هستند که می‌توانند جایگزین مناسبی برای آنالیز دستی DNA باشند.

تجزیه و تحلیل قطعه DNA با یک آنالایزر DNA بسیار مقرون به صرفه و امکان‌پذیر خواهد شد. همچنین خطر آلودگی را کاهش می‌دهد زیرا نمونه برداری خودکار می‌باشد.

اصول کاری آنالایزر DNA

آنالایزر DNA یک ابزار خودکار است که در آن توالی‌یابی و آنالیز قطعات DNA با الکتروفورز کپیلاری (Capillary electrophoresis) بر اساس اندازه آن‌ها، انجام می‌شود. در الکتروفورز کپیلاری، یک الکترود کاتد در نمونه قرار می‌گیرد و تحت میدان الکتریکی، DNA با بار منفی از طریق کپیلاری به سمت آند جابجا می‌شود. این جابجایی به جداسازی قطعات DNA کمک می‌کند. در این‌جا، قطعات DNA کوچک‌تر سریع‌تر از قطعات DNA بزرگتر جابجا می‌شوند و زود به آشکارساز می‌رسند.

DNA به یک پرایمر نشانه‌گذاری شده با فلورسنت متصل است. هنگامی که DNA با پرایمرهای نشانه‌گذاری شده با فلورسنت از پنجره تشخیص (Detection window) در طول فرایند جابجایی، عبور می‌کند، یک پرتو باریک از نور لیزر، رنگ‌های فلورسنت را تحریک می‌کند. این تحریک، طول موج نوری بیشتری از طول موج لیزر ساطع می‌کند. این پرتوهای نور از توری پراش (Diffraction grating) عبور می‌کنند، که آن‌ها را به آشکارساز CCD (charged-coupled device) هدایت می‌کند.

CCD بر اساس طول موج، DNA را شناسایی می‌کند. یک لدر اندازه داخلی (Internal size ladder)، لدر آللی (allelic ladder) و یک برنامه نرم‌افزاری، پیک‌های شناسایی شده را انتخاب می‌کنند و یک نام آللی برای یک مکان مشخص ارائه می‌دهند. این ترکیب از تمام پیک‌های رنگ فلورسنت باعث ایجاد یک الکتروفروگرام (electropherogram) می‌شود.

اجزای آنالایزر DNA

1. درب: دو درب در آنالایزر DNA وجود دارد: درب اوون (Oven) و درب ابزار. درب اوون در قسمت داخلی دستگاه قرار دارد. قسمت بیرونی دستگاه دارای در شیشه‌ای می‌باشد.
2. دکمه پاور: در بیرونی‌ترین قسمت آنالایزر DNA وجود دارد و کار روشن یا خاموش کردن دستگاه را انجام می‌دهد.
3. نشانگرهای LED: این نشانگرها مشخص می‌کنند که دستگاه در حال کار است یا خیر و درست در کنار دکمه پاور قرار دارند.
4. کیسه/مخزن پلیمر: پلیمر مورد نظر را برای آزمایش فراهم می‌کند.
5. پمپ رسانش پلیمر: از طریق لوله تامین پلیمر و لوله به هم پیوسته به ترتیب به مخزن پلیمری و مخزن بافر آند متصل می‌شود. این قطعه پلیمر را به Array پمپ می‌کند.
6. بلاک پمپ: از یک مجموعه ابزار تزریق، آب‌بند، پیستون، محفظه پمپ و دریچه آب تشکیل شده است. کارکرد آن کنترل پمپ رسانش پلیمر است.
7. بلاک پلیمری پایینی: از یک شیر بافر تشکیل شده است. به محفظه بافر آند و پمپ تحویل پلیمر متصل می‌شود و به عنوان کنترل کننده جریان آند از محفظه عمل می‌کند.
8. مجموعه کپیلاری: این مجموعه یک واحد جایگزین است (8 یا 24 کپیلاری موجود می‌باشد) و جداسازی قطعات DNA نشانه‌گذاری شده با فلورسنت را از طریق الکتروفورز امکان‌پذیر می‌کند.
9. پلیت حرارتی (Heat plate): به حفظ دمای مجموعه کپیلاری به طور ثابت کمک می‌کند.
10. نمونه‌گیر خودکار: این قسمت مخزن بافر کاتدی و پلیت نمونه‌برداری را در خود جای می‌دهد. این ابزار کمک می‌کند تا ظرف و مخزن بافر کاتد بدون دخالت انسان به طور مناسب هم‌تراز شوند.
11. مخزن بافر کاتد: شامل یک بافر جاری برای پشتیبانی از الکتروفورز است و به حفظ ارتفاع سیال به طور ثابت در طول آزمایش کمک می‌کند.
12. مخزن زباله: زباله‌های دور ریخته شده مانند بافر، آب و پلیمرها را پس از اتمام آزمایش جمع آوری می‌کند.
13. مخزن آب: آب را برای آزمایش در خود نگه می‌دارد.

ابزارهای بیشتر

1. نرم افزار کامپیوتری: نوع، نسخه و عملکرد نرم افزار کامپیوتری بسته به شرکت سازنده نمونه DNA می‌باشد.
2. ظرف آزمایشگاهی چاهک‌دار 96 تایی (96 well plate): ظرف آزمایشگاهی چاهک‌دار 96 تایی مشابه کیت تست الایزا (ELISA) است.

راه اندازی آنالایزر ژنتیکی

برای راه اندازی یک آنالایزر DNA، کالیبراسیون و تنظیمات مناسب ضروری است. در زیر مراحل کالیبراسیون و تنظیم یک آنالایزر DNA آمده است:

کالیبراسیون یک آنالایزر DNA

دو نوع کالیبراسیون در آنالایزر DNA انجام می‌شود: فضایی و طیفی

• کالیبراسیون فضایی (Spatial calibration): کالیبراسیونی است که هنگام استفاده از ابزار برای اولین بار انجام می‌شود. در این‌جا نرم افزار حذف شده و برای کالیبراسیون، مجدد نصب می‌شود. همچنین زمانی که تغییراتی در کپیلاری و پلیت ایجاد می‌شود و هنگامی که ابزار جابجا می‌شوند، این کالیبراسیون صورت می‌پذیرد.

• کالیبراسیون طیفی (Spectral calibration): این کالیبراسیون هر زمان که از رنگ جدید استفاده شود، لیزر تغییر کند، دوربین CCD جایگزین شود، پیک‌های نادرست به طور مداوم مشاهده شود، و هنگامی که مجموعه کپیلاری پلیت تغییر کند، انجام می‌شود. استاندارد کالیبراسیون را از طریق هر کپیلاری اجرا کنید. هر استاندارد دارای یک ماژول طیفی خاص است که بر اساس آن ماتریس‌های کپیلاری‌های مختلف پذیرفته و رد می‌شوند (ماژول به همراه تجهیزات ارائه شده است).

تنظیم ابزار

1. مجموعه کپیلاری مورد نظر را برداشته و آن را داخل دستگاه قرار دهید. کالیبراسیون فضایی را پس از قرار دادن مناسب مجموعه کپیلاری در دستگاه انجام دهید.
2. سپس پلیمر مورد نظر را انتخاب کرده و کیسه پلیمر را در دستگاه قرار دهید. مطمئن شوید که مقدار پلیمر برای چرخه کامل کافی است.
3. برای پر کردن مخزن آب و بافر، نمونه‌بردار خودکار را به جلو بیاورید، به آرامی هر ظرف را جدا کرده و مایع باقی‌مانده را دور بریزید. پس از شستشوی کامل (ابتدا با آب دیونیزه و سپس بافر/آب، به ترتیب) و تمیز کردن با استفاده از پارچه‌های بدون پرز، به آرامی 80 میلی‌لیتر از بافر و آب را در ظرف مربوطه بریزید. بافر را در سینی مربوطه قرار دهید، درب دستگاه را ببندید و دکمه سینی را فشار دهید تا نمونه‌بردار خودکار به موقعیت درست حرکت کند.
4. پر کردن شیشه بافر آند: شیشه را باز کرده و با آب دیونیزه تمیز کنید. دوباره با استفاده از بافر آند شستشو دهید. سپس 67 میلی‌لیتر بافر آند را در شیشه بریزید. هنگام بستن شیشه به ابزار، مطمئن شوید که الکترود در داخل بافر شیشه فرو رفته است.

مراحل کار با آنالایزر DNA

هنگامی که قطعات و ابزار آنالایزر DNA به درستی تنظیم شدند و کالیبراسیون مورد نیاز انجام شد، مراحل زیر برای اجرای یک چرخه توالی‌یابی موفق انجام می‌شود:

1. ابتدا پلیت را به درستی سرهم کنید.
2. سپس پلیت را داخل دستگاه قرار دهید.
3. نرم افزار را در کامپیوتر باز کنید و برای تاریخ و زمان مورد نظر برنامه را اجرا کنید.
4. چرخه توالی‌یابی را اجرا کنید. زمان تعیین توالی DNA به نوع توالی‌یابی انجام شده بستگی دارد. به عنوان مثال، برای یک توالی‌یابی DNA طولانی می‌توان 120 دقیقه برنامه را اجرا کرد و برای توالی‌یابی DNA استاندارد می‌توان 60 دقیقه برنامه را اجرا کرد.
5. زمان واقعی (Real-time)، داده‌های تاریخچه اجرا و الکتروفروگرام را می‌توان در طول یا بعد از اتمام چرخه توالی‌یابی مشاهده کرد.

موارد استفاده از آنالایزر ژنتیکی

آنالایزر DNA یک دستگاه مدرن و پیشرفته برای انجام آنالیز DNA در آزمایشگاه‌های مختلف است. این دستگاه می‌تواند برای توالی‌یابی Sanger، ژنوتیپ‌یابی (Genotyping)، نمایه سازی STR و SNP، آنالیز جهش ژنی و غیره مناسب باشد. موارد زیر حوزه کاربرد آنالایزر DNA هستند:

1. علم پزشکی قانونی: تکنیک مولکولی، به ویژه تعیین توالی ژن، به طور گسترده‌ای در علم پزشکی قانونی استفاده می‌شود. بنابراین جایگزینی بیشتر کارهایی که در توالی یابی DNA به صورت دستی انجام می‌شود با یک آنالایزر DNA، زمان مورد نیاز را کاهش می‌دهد. همچنین احتمال آلودگی متقاطع (Cross-contamination) را کاهش می‌دهد. نمونه‌بردار DNA همچنین در آنالیز قطعات مختلف DNA مفید است.
2. آزمایشگاه‌های تحقیقاتی مرتبط با میکروارگانیسم‌ها: آنالیز ژنی باکتری‌ها و ویروس‌ها معمولاً در حین تحقیق روی میکروارگانیسم‌ها، مورد علاقه می‌باشد. بنابراین، یک آنالایزر DNA می‌تواند جایگزینی ایده‌آل برای کارهای دستی خسته کننده باشد.
3. آزمایشگاه‌های مرتبط با سرطان: نمونه‌بردار DNA به تشخیص جهش ژنتیکی کمک می‌کند و در آزمایشگاه‌های مرتبط با سرطان برای تشخیص علت اصلی سرطان مفید خواهد بود.

مزایای آنالایزر DNA

1. تعداد زیاد پردازش نمونه: مجموعه کپیلاری به پردازش 48 تا 96 نمونه به طور همزمان کمک می‌کند، بنابراین این دستگاه به پردازش تعداد زیادی از نمونه‌ها کمک می‌کند.
2. زمان کمتر: از آن‌جایی که می‌تواند چندین نمونه را پردازش کند و به کار دستی بسیار کمتری نیاز دارد، زمان کمتری صرف آن می‌شود. به علاوه، این کار یک فرآیند خودکار است. وقتی ماشین کار می‌کند، شخص می‌تواند کارهای دستی دیگر را انجام دهد.
3. کارآمدتر بودن: آنالایزرهای DNA فقط به منابع انسانی آموزش دیده نیاز دارند تا نتایج حداقل 48 نمونه را در زمان بسیار کمی ارائه دهند. بنابراین باعث افزایش راندمان آزمایشگاه‌ها می‌شود.
4. آلودگی متقاطع کمتر: از آن‌جایی که نمونه برداری خودکار است، احتمال بروز آلودگی متقاطع به طور قابل توجهی کمتر یا حتی صفر است.

همچنین بخوانید:

• تجهیزات پزشکی آزمایشگاه تشخیص مولکولی
• 19 دستگاه مورد استفاده در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا