مهندسی ژنتیک و کلونینگ, ویدیو های آموزشی
وسترن بلاتینگ -بخش اول- دوبله ژنیران
وسترن بلاتینگ، پارت اول
با مشاهده سه ویدیو پیش رو، شما با یک تکنیک تجربی تحت عنوان وسترن بلات آشنا می شوید.
وسترن بلات تکنیکی است که به محققان کمک می کند تا تغییرات یک پروتئین خاص را مشخص کنند. به عنوان مثال تغییر در غلظت، اضافه یا کم شدن گروه های شیمیایی که تحت عنوان مدیفیکاسیون شناخته می شوند و تغییرات اتصالات بین پروتئین ها.
در تکنیک وسترن بلاتینگ، پروتئین ها ابتدا از سایر ترکیبات سلولی جدا می شوند. برای استخراج پروتئین ها از سلول، محققین از متد های شیمیایی و فیزیکی مختلف جهت شکستن غشای پلاسمایی استفاده می کنند. در روش های شیمیایی لیز سلولی و قابل دسترس کردن پروتئین، از انواع مختلف دترجنت ها استفاده می شود. به عنوان مثال دترجنت های ضعیف برای استخراج پروتئین های قابل حل در آب که درون سلول هستند، استفاده می شود و این روش هیچ اختلالی در پروتئین های غشای داخل سلولی بوجود نمی آورد. دترجنت های قوی توانایی حل کردن و در دسترس قرار دادن پروتئین هایی را که در تمامی غشاء ها یافت می شوند، دارند. در ادامه لیز سلولی، سلول ها و سایر محتویاتشان توسط میکرو سانتریفیوژ، مورد چرخش قرار می گیرند. نتیجه بوجود آمدن یک سوپرناتانت آبی خواهد بود که شامل پروتئین های حل شده در آن می باشد و همچنین زیر آن رسوب شکل می گیرد که شامل غشاء ها، اندامک ها، نوکلئیک اسید و هر پروتئین غیر قابل حل می باشد. سوپرناتانتی که از رسوب برای انجام وسترن بلاتینگ جدا می شود، پروتئین Lysate نامیده می شود. معمول ترین نوع پروتئین Lysate که محققان آماده می کنند، Whol Cell Lysate نامیده می شود چرا که شامل تمامی پروتئین های سلولی می باشد. دو نوع معمول از Lysate ها، Lysate هسته ای و Lysate سیتوپلاسمی می باشند که به ترتیب فقط پروتئین های هسته ای و پروتئین های سیتوپلاسمی را در بر می گیرند و اغلب این دو Lysate را برای مطالعه تنظیم محل قرارگیری پروتئین ها آماده می کنند. چهارمین نوع Lysate معمول Immunoprecpitate و یا IP نامیده می شود. Lysate نوع IP جهت تشخیص و تأیید پروتئین هایی که می توانند با پروتئین های خاص دیگری اینتراکشن بدهند، آماده می شود. برای تأیید یک IP پروتئین مورد نظر از Lysate پروتئینی با اضافه کردن یک آنتی بادی که به شکل مخصوص پروتئین مورد نظر را شناسایی می کند، جدا می شود. البته این جدا سازی بوسیله آنتی بادی ثانویه که به یکسری مولکول های مهره مانند متصل شده اند، انجام می شود. آنتی بادی ثانویه با اتصال به آنتی بادی متصل به پروتئین مورد نظر، کمپلکس پروتئین آنتی بادی را شکل داده و بدین وسیله درون Lysate پروتئینی رسوب کرده و از آن جدا می شود. بدین ترتیب محققین با این روش پروتئین مورد نظر خود را همراه با پروتئین های دیگری که با آنتی بادی اینتراکشن فیزیکی داشته باشند، جدا می کنند. لیز سلولی باعث اختلال در محیط سلولی که با دقت کنترل شده است، می شود. این عمل با در دسترس قرار دادن پروتئین مورد نظر در جوار آنزیم هایی که قبلا دسترسی به آن پروتئین را نداشتند، می تواند موجب مدیفیکاسیون ناخواسته پروتئین، آنفولد شدن و قطعه قطعه شدن پروتئین شود. برای جلوگیری از این اتفاقات ناخواسته، پروسه لیز کردن در دمای پایین و در حضور مهار کننده های مختلف آنزیمی انجام می شود.
وسترن بلاتینگ می تواند به دو فاز اصلی تقسیم شود. در فاز اول پروتئین ها درون یک ژل لود می شوند و تحت تأثیر جریان الکتریکی از هم جدا می شوند و این فاز الکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید و یا PAGE نامیده می شود.
سپس در فاز دوم پروتئین های جدا شده به یک غشاء منتقل شده و پروتئین مورد نظر با استفاده از آنتی بادی قابل مشاهده شده و تشخیص داده می شود. در قسمت دوم این ویدیو توضیحات بیشتری از فاز الکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید و یا PAGE داده خواهد شد.
با ما همراه باشید.
جهت مشاهده قسمت دوم اینجا کلیک کنید
همچنین از صفحات زیر دیدن فرمایید:
کارآموزی ژنتیک مهندسی ژنتیک و کلونینگ
خدمات و تجهیزات آزمایشگاهی مهندسی ژنتیک و کلونینگ
مطالب علمی بیشتری را در ویکی ژن مطالعه فرمایید…
