الکتروفورز ژل آکریل آمید: اصول، پروتکل و کاربردها

مقدمه‌ای بر الکتروفورز ژل آکریل آمید

در حالی که الکتروفورز ژل آگارز به طور گسترده برای جداسازی قطعات DNA بزرگتر از ۱۰۰ جفت باز استفاده می‌شود، الکتروفورز ژل پلی‌آکریل ‌آمید (PAGE) وضوح بسیار بالاتری را ارائه می‌دهد و برای جداسازی قطعات DNA کوچک (۵ تا ۵۰۰ جفت باز) با دقت تک ‌باز ایده‌آل است. ژل‌های آکریل ‌آمید همچنین در کاربردهایی که قدرت تفکیک بالا و تعریف دقیق باند مورد نیاز است، مانند توالی‌یابی DNA، تشخیص جهش و تجزیه و تحلیل الیگونوکلئوتید، ترجیح داده می‌شوند.

این مقاله اصول، مواد، روش و کاربردهای الکتروفورز ژل آکریل ‌آمید را به طور خاص برای تجزیه و تحلیل DNA بررسی می ‌کند.

اصول الکتروفورز ژل آکریل آمید برای DNA

ژل‌های پلی‌آکریل آمید از طریق پلیمریزاسیون مونومرهای آکریل آمید با یک عامل پیوند دهنده عرضی مانند N,N′-متیلن ‌بیس ‌آکریل آمید (بیس-آکریل آمید) تشکیل می‌شوند. ماتریس حاصل، محکم و یکنواخت است و وضوح بالاتری نسبت به آگارز ارائه می‌دهد. مولکول‌های DNA بر اساس طول و ساختارشان، تحت یک میدان الکتریکی از طریق این ماتریس ژل مهاجرت می ‌کنند و قطعات DNA کوتاه ‌تر، سریع‌ تر از قطعات بلندتر مهاجرت می‌کنند.

برخلاف PAGE پروتئین، PAGE DNA معمولاً بسته به کاربرد، تحت شرایط دناتوره کننده (مثلاً اوره) یا غیر دناتوره کننده انجام می‌شود.

ابزار و وسایل مورد نیاز

• سیستم الکتروفورز عمودی PAGE
• منبع تغذیه (با قابلیت ولتاژ ثابت)
• صفحات شیشه‌ای با فاصله ‌دهنده و شانه
• پیپت‌ها و میکروسانتریفیوژ
• بلوک گرمایش ژل (در صورت استفاده از ژل دناتوره کننده)
• ترانس ایلومیناتور UV یا تصویرساز ژل (ژل داک)
• هود شیمیایی برای کار با آکریل آمید

مواد شیمیایی و معرف‌های مورد نیاز

اجزای ژل:

• محلول آکریل امید/بیس-آکریل امید (نسبت رایج: ۱۹:۱ یا ۲۹:۱)
• اوره (برای ژل‌های دناتوره کننده، معمولاً ۷-۸ مولار)
• بافر (TBE)یا (TAE)
• آمونیوم پرسولفات (APS) – آغازگر پلیمریزاسیون
• TEMED – پلیمریزاسیون را کاتالیز می‌کند
• آب مقطر یا آب دیونیزه

آماده‌سازی نمونه:

• نمونه DNA (محصولات PCR، الیگونوکلئوتیدها و غیره)
• Loading dye (با رنگ‌هایی مانند بروموفنول بلو و زایلن سیانول)
• فرم آمید + EDTA برای دناتوره کردن DNA (اختیاری)

رنگ‌آمیزی و مشاهده:

• اتیدیوم بروماید، SYBR Gold یا GelRed برای رنگ ‌آمیزی DNA
• منبع نور UV یا سیستم تصویربرداری

آماده‌سازی و پروتکل

مرحله ۱: بستن Cast

۱. محلول پلی‌اکریل ‌آمید را آماده کنید:

o برای DNA با وضوح بالا (مثلاً کمتر از ۱۰۰ جفت باز)، از ۱۵ تا ۲۰٪ آکریل ‌آمید استفاده کنید.

o برای قطعات بزرگتر (۱۰۰ تا ۵۰۰ جفت باز)، از ۶ تا ۱۲٪ آکریل ‌آمید استفاده کنید.

۲. در صورت دناتوره کردن:

o اوره (۷ تا ۸ مولار) اضافه کنید و محلول را گرم کنید تا حل شود.

۳. برای شروع پلیمریزاسیون، ۱/۱۰ حجم ۱۰٪ APS و ۰.۱٪ TEMED اضافه کنید.

۴. ژل را بین صفحات شیشه ‌ای بریزید و شانه را وارد کنید.

۵. اجازه دهید پلیمریزه شود (حدود ۳۰ تا ۴۵ دقیقه در دمای اتاق).

مرحله ۲: آماده‌سازی نمونه

• DNA را با Loading dye فرم آمید (دناتوره کننده) یا Loading buffer استاندارد مخلوط کنید.
• در صورت دناتوره شدن، به مدت ۳ تا ۵ دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد حرارت دهید، سپس روی یخ قرار دهید.
• برای جمع‌آوری نمونه، به مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید.

مرحله ۳: آماده‌سازی الکتروفورز

۱. شانه را با دقت از ژل خارج کنید.

۲. ژل را در مخزن الکتروفورز قرار دهید و بافر TBE اضافه کنید.

۳. نمونه‌های DNA و  Ladderرا در چاهک‌ها قرار دهید.

۴. ژل را در ولتاژ ۸۰ تا ۲۰۰ ولت، بسته به ضخامت ژل و اندازه قطعه، run کنید.

زمان معمول اجرا: ۱ تا ۲ ساعت یا تا زمانی که رنگ به انتهای ژل نزدیک شود.

مرحله ۴: رنگ‌آمیزی و مشاهده

• اگر DNA از قبل رنگ نشده باشد:

o ژل را پس از run در محلول اتیدیوم بروماید (۰.۵ میکروگرم در میلی‌لیتر) یا SYBR به مدت ۱۰ تا ۳۰ دقیقه رنگ‌آمیزی کنید.

• زیر یک ترانس ‌ایلومیناتور UV یا سیستم تصویربرداری با نور آبی مشاهده کنید.

کاربردهای DNA PAGE

۱. توالی ‌یابی DNA

قبل از توالی‌ یابی capillary خودکار، از ژل ‌های آکریل ‌آمید برای تفکیک قطعات DNA که تنها در یک نوکلئوتید با هم تفاوت دارند، با استفاده از توالی ‌یابی سنگر استفاده می ‌شد.

۲. خالص‌سازی الیگونوکلئوتید

PAGE می‌تواند الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی را خالص‌سازی کند و محصولات کامل را از محصولات کوتاه‌ شده با وضوح تک‌ بازی تفکیک کند.

۳. تشخیص جهش

• چند شکلی ساختار تک ‌رشته ‌ای (SSCP): قطعات DNA با ساختار متفاوت (به دلیل جهش) به طور متفاوتی مهاجرت می‌ کنند.
• آنالیز هترودوپلکس: در تشخیص mismatch استفاده می ‌شود.

۴. آنالیز قطعات کوتاه PCR

در genotyping، آنالیز microsatellite، آنالیز STR و علوم پزشکی قانونی استفاده می‌ شود.

۵. آنالیز RNA

روش Urea-PAGE همچنین برای گونه ‌های کوچک RNA (مانند miRNAها، siRNAها، tRNAها) استفاده می‌شود، اگرچه پروتکل‌های جداگانه ‌ای برای آن اعمال می‌ شود.

تفسیر نتایج

• DNA از منفی به مثبت (به سمت آند) مهاجرت می‌کند.
• قطعات DNA کوچکتر،سریع ‌تر مهاجرت می‌کنند و در ژل پایین ‌تر ظاهر می‌شوند.
• یک نشانگر وزن مولکولی (Ladder DNA) برای تخمین اندازه قطعه ضروری است.
• نوارهای sharp و مشخص و متمایز نشان ‌دهنده کیفیت خوب نمونه و تفاوت‌های دقیق اندازه هستند.

ملاحظات جابجایی و ایمنی

ایمنی آکریل آمید:

• به شکل مونومری سمی است – نوروتوکسیک و بالقوه سرطان ‌زا است.
• همیشه از دستکش، روپوش آزمایشگاهی و محافظ چشم استفاده کنید.
• آماده سازی محلول ها و ریختن ژل را در زیر هود انجام دهید.
• در صورت وجود، برای کاهش خطر، از ژل ‌های آماده استفاده کنید.

جابجایی اتیدیوم بروماید:

• جهش‌زا – محلول‌ها و ژل‌های رنگ‌ آمیزی را به عنوان زباله‌ های خطرناک دور بریزید.
• در صورت امکان از جایگزین ‌های ایمن ‌تر مانند SYBR Safe یا GelRed استفاده کنید.

اقدامات احتیاطی عمومی:

• برای جلوگیری از smear، از پر کردن بیش از حد چاهک ‌ها خودداری کنید.
• از ابزارها و معرف‌های تمیز و عاری از RNAse/DNAse استفاده کنید.
• در هنگام ریختن و پلیمریزاسیون، حباب‌های هوا را بررسی کنید.

نکاتی برای موفقیت

• درصد ژل بالاتر = وضوح بهتر برای قطعات کوچک، اما شکننده ‌تر.
• قبل از لود کردن نمونه ها ژل را برای مدت کوتاهی run کنید تا گرم و متعادل شود.
• قبل از بارگذاری در ژل‌های دناتوره کننده، از فرم آمید و حرارت برای دناتوره کردن DNA استفاده کنید.
• برای پلیمریزاسیون بهینه، همیشه از APS و TEMED تازه استفاده کنید.
• برای جلوگیری از آسیب DNA در حین تصویربرداری، از قرار گرفتن بیش از حد در معرض اشعه ماوراء بنفش خودداری کنید.

تکنیک‌های جایگزین

• الکتروفورز ژل آگارز – برای DNA بزرگتر (>500 جفت باز) بهتر است
• الکتروفورز capillary – برای تجزیه و تحلیل خودکار با توان عملیاتی بالا
• سیستم‌های میکروفلوئیدیک/مبتنی بر تراشه – جداسازی سریع و کم حجم DNA

نتیجه‌گیری

الکتروفورز ژل آکریل آمید ابزاری قدرتمند برای جداسازی قطعات کوچک DNA با وضوح بالا است. این روش برای اندازه‌ گیری دقیق قطعات DNA، کنترل کیفیت الیگونوکلئوتیدها، تشخیص جهش و کاربردهای تعیین توالی ضروری است. با وجود ظهور تکنیک‌های مدرن ‌تر، DNA PAGE همچنان در تحقیقات دانشگاهی و تشخیص‌های بالینی که نیاز به وضوح بالا دارند، ارزشمند است.

با تکنیک و ایمنی مناسب، باعث جداسازی DNA به طور واضح، تکرارپذیر و با جزئیات دقیق می شود که ژل‌های آگارز نمی‌توانند به آن دست یابند.

• دوره مهارت آموزی ژنتیک مولکولی
• خدمات آزمایشگاهی بخش ژنتیک مولکولی
• تجهیزات آزمایشگاهی ژنیران