دیفریز سلول، پاساژ و فریز کردن سلول ها

مقدمه‌ای بر دیفریز سلول، پاساژ و فریز کردن سلول ها

یکی از پایه ترین تکنیک ها در حوزه کشت سلول دفریز، پاساژ و فریز گرفتن از سلول های جانوری می باشد. زمانی که سلول ها در بافت میزبان بوده اند، در اثر اتصالات بین سلولی و یکپارچگی بافت و همچنین از طرفی فاکتور های موجود در فضای بین سلولی، سلول ها در یک حالت تعادلی باقی مانده و در اثر هر بار تقسیم سلول های دختری حاصله، عیناً همانند سلول مادری خود می باشند.

اما از طرفی در تکنیک کشت سلول، سلول ها به شکل منفصل از هم، رشد در محیطی نسبتا جدید را تجربه کرده و طی گذشت زمان و تکثیر سلول ها به دلیل وجود فواصل بین سلول ها و در اثر عوامل محیطی تکوین سلولی رخ داده؛ برخی ژن ها که قبلا روشن بوده اند خاموش می شوند و تعدادی از ژن هایی که خاموش بودند، روشن شده و بیان می شوند.

لذا فاکتور گذشت زمان و تکثیر متوالی سلول ها یک عامل منفی بوده و موجب می گردد پس از گذشت زمان نسبتا طولانی، سلول ها دیگر شباهتی به بافتی که از آن استخراج شده اند، نداشته باشند. مسئله دیگر وجود هزینه هنگفت برای نگهداری طولانی مدت سلول ها می باشد. چراکه اگر سلول ها درون فلاسک های کشت سلول در مدت زمان طولانی، درون انکوباتور نگهداری شوند، به شکل مستمر نیاز به تعویض محیط کشت سلول ها و رساندن مواد غذایی می باشند و همچنین سیستم انکوباتور CO2 باید تمام مدت روشن بماند.

از طرفی پس از اتمام هر پروژه پژوهشی نمی توان رده سلولی مربوط به آن را دور انداخت؛ چرا که رده های سلولی در سطح دنیا ثابت بوده و از میزبان های خاصی گرفته شده اند و به دلیل یکسان سازی شرایط پروژه های مختلف از رده های مشخص و تأیید شده جهانی استفاده می شود.

چنین مسائلی موجب گشته تا راهکاری برای نگهداری طولانی مدت سلول ها و تهیه بانک های سلولی ثابت، ارائه شود. این راهکار فریز کردن سلول ها می باشد. پژوهشگران با استفاده از متد های خاصی پس از آن که دیگر نیازی به رده سلولی خاصی ندارند آن را فریز کرده و برای مدت های طولانی نگهداری می کنند.

جهت فریز و Storage سلولی، سلول ها به همراه FBS ابتدا به درون تیوب مخصوص فریز (Cryovial) منتقل شده و جهت جلوگیری از شکست سلولی به واسطه کریستال های حاصله از انجماد، مقداری DMSO به آن اضافه می شود. در نهایت به سرعت سلول ها به فریزر مخصوص و تانک ازت منتقل شده و برای مدت های طولانی نگهداری می شوند. همچنین زمانی که دوباره نیاز به استفاده از همان رده سلولی باشد، با تکنیک دیفریز سلول ها برای کشت مجدد آماده می شوند.

باید توجه داشت که فضای فلاسک های کشت سلولی محدود بوده و سلول ها زمانی که در فاز تصاعدی رشد هستند، زمانی فرا می رسد که دیگر جایی برای رشد ندارند و این امر موجب کشته شدن سلول ها به دلیل کمبود جا می شود. لذا علاوه بر نیاز سلول ها به تعویض مرتب محیط کشت، نیاز به تأمین فضای کافی جهت رشد دارند. لذا زمانی که تعداد سلول ها افزایش یافته و فضای درون فلاسک کفاف آن ها را نمی دهد، با تکنیک پاساژ (Subculture) فضای مناسب برای رشد سلول ها تأمین می شود.

پاساژ (Subculture) سلول ها به چندین شکل انجام می شود. برخی اوقات سلول های یک فلاسک کوچک به یک فلاسک بزرگتر جهت تأمین فضای بیشتر منتقل می شود. اما در مواردی ممکن است محققان نیاز به تعداد فلاسک های بیشتری از سلول های خود برای انجام آزمایش های مختلف داشته باشند. در اینصورت سلول ها از فلاسک با تراکم مناسب (Confluency) به دو فلاسک منتقل می شوند.

در این روش می توان سلول ها را به دو فلاسک جدید منتقل نموده و یا نصف آن را به یک فلاسک جدید منتقل کرده و نصف دیگر را دوباره در فلاسک قدیمی کشت داد. همچنین برخی اوقات برای انجام پروژه تحقیقاتی و ضمن آن Storage همزمان سلول، بخش اعظمی از سلول های یک فلاسک فریز شده و باقی مانده سلولی دوباره درون همان فلاسک کشت داده می شوند.

آزمایشگاه ژنیران طی دوره کارآموزی کشت سلول های جانوری، هرسه تکنیک دیفریز، پاساژ و فریز سلولی را به دانشجویان و علاقه مندان آموزش داده و تمامی شرکت کنندگان خود به تنهایی هر یک از تکنیک های مذکور را به انجام رسانده و به خوبی فرا می گیرند.

دیفریز سلولی یا ذوب سلولی

پیشینه ذوب­شدن یا دیفریز

سلول‌درمانی‌های حساس به دما، مراقبت‌های بالینی را متحول می‌کنند و تداوم مدیریت زنجیره سرما را در ارائه درمان‌ها به بیماران ضروری می‌سازند. از جمع­آوری آفرزیس تا کلینیک، کنترل شرایط ذخیره­سازی کرایوبیولوژیکی به دلیل فرآیندهای چند مرحله­ای درگیر در ایجاد یک سلول‌درمانی تمام شده همراه با عدم قطعیت­های اجتناب­‌ناپذیر در مورد زمان و مکان تجویز، پیچیده است.

درمان‌های انجماد زیر ۱۲۰- درجه سانتیگراد، ذخیره‌سازی پایدار و طولانی ‌مدت را در بانک سلولی تا زمان نیاز به درمان ارائه می‌دهند.

مدیریت زنجیره سرما شامل سه مرحله کلیدی است:

1. کاهش دما
2. شرایط ذخیره­سازی نگهداری
3. ذوب­شدن یا دیفریز

برای سیستم‌های سلولی بالینی، دو فاز اول معمولاً با استفاده از پروتکل‌های معتبر و فریزرهای خودکار با نرخ کنترل‌شده و معین کنترل و ضبط می‌شوند. هشدارهای خودکار و سیستم‌های نظارت نیز برای اطمینان از شرایط ذخیره‌سازی پایدار در بانک‌های سلولی ضروری هستند.

ذوب یا دیفریز کارآمد، با حداقل تأثیر بر زنده­مانی و عملکرد، یک پروسه مهم است. اشتباهات در دیفریز یک درمان بالقوه می­تواند اثربخشی درمان را به خطر بیندازد و منجر به تأثیر قابل­توجهی بر بیمار و همچنین هزینه‌­های بالا و به خطر افتادن شهرت برای توسعه­دهنده محصول شود.

برای ایمونوتراپی‌های اصلاح‌شده با ژن و سلول‌درمانی‌هایی که نیاز به ساخت بسیار تخصصی دارند، مواد بیولوژیکی اولیه ممکن است بلافاصله پس از به دست آمدن، فریز شود و سپس به محل پردازش ارسال شود.

نمونه سپس دیفریز و پردازش می­شود (به عنوان مثال، استخراج جمعیت سلولی موردنظر، فعال­سازی یا انتقال/ویرایش ژن، و هاروست) و قبل از انجماد مجدد برای بار دوم به محل بیمار قبل از ذوب نهایی و تجویز برگردانده می­شود. هم فریز و هم دیفریز در چند مرحله در جریان کار اتفاق می‌افتد (شکل 1)، و هر گونه اثرات مضر ناشی از این فرآیندها باید تا حد امکان به حداقل برسد.

این راهنما، دیفریز را به دنبال روش‌های معمولی فریز آهسته خلاصه می‌کند. ما به این موضوع می‌پردازیم که چگونه ذوب سلولی از لحاظ تاریخی به تکنیک‌های جدید مورد استفاده امروزه، همراه با مفاهیم فیزیکی و بیولوژیکی معیارها و اجزای کلیدی، مانند سرعت کاهش دما و ساختار یخ تبدیل شده است. همچنین مروری بر مطالعات کلیدی از متون علمی، و در نظرگرفتن تعاملات بین نرخ کاهش و افزایش دما، که در درمان‌های سلولی و ژنی قابل استفاده است، گنجانده شده است. ما فریز به روش سریع ، روشی تخصصی که برای اکثر سلول‌درمانی‌ها نامناسب است را، در نظر نمی‌گیریم.

شکل 1. یک زنجیره انجمادی معمول – مرحله ذوب معمولاً دو بار در طول فرآیند ساخت سلول­درمانی اتفاق می­افتد: پس از رسیدن ماده اولیه به محل تولید و قبل از تزریق.

تاریخچه ذوب یا دیفریز

فرآیندهای دیفریز برای مواد فریزشده از لحاظ تاریخی شامل یک روش نسبتا ساده با یک عنصر قوی و ذهنی بوده است. به طور معمول، یک ویال فریزشده در یک حمام آب در دمای 37 درجه سانتیگراد غوطه ور می‌شود و زمان ذوب آخرین مقدار یخ (ذوب مرطوب) موجود در ویال در حمام به صورت بصری تعیین می­شود. این روش، ساده و ارزان و تثبیت شده است، اما برای موفقیت و ثبات به یک تکنسین متخصص نیاز دارد. تغییر در روش اجرای کاربر و تنظیمات آزمایشگاهی می­تواند باعث تغییر در مدیریت دمای محصول شود.

حمام­های آب خود مشکلاتی را در محیط­های بالینی و کلین روم­ها ارائه می­دهند. علاوه بر خطر تغییر فرآیند و محصول، وجود حمام آب یک ریسک آلودگی را ایجاد می­کند که در تنظیمات کنترل­شده غیرقابل قبول است. زمان و امکانات برای استریل­کردن، گرم­کردن مجدد، پر­کردن مجدد و تثبیت دما نیز باید دردسترس باشد.

در پاسخ به این محدودیت‌ها، دستگاه‌های ذوب بدون دخالت آب که قادر به جابجایی نمونه‌های بزرگ‌تر در کیسه‌های سرمایشی هستند، مورد توجه قرار گرفته‌اند. این سیستم‌ها تنوع کاربر به کاربر را حذف می‌کنند و یک فرآیند سازگار و قابل برنامه‌ریزی را ارائه می‌کنند که مداخلات کاربر، از جمله گزینه‌هایی برای کنترل کامپیوتری، نظارت و ضبط داده‌ها را به حداقل می‌رساند. مطالعات نشان داده‌اند که ذوب خشک می‌تواند با موفقیت در مواد درمانی غیرسلولی مانند پلاسما نیز اعمال شود که انگیزه بیشتری برای پذیرش این دستگاه‌ها در مقیاس وسیع است.

نرخ دیفریزکردن

کاهش دما کنترل‌شده برای ذوب پایدار: نرخ‌های کاهش دما در فریز و ذوب در دیفریز ذاتاً به هم مرتبط هستند و در نظرگرفتن یکی بدون دیگری امکان‌پذیر نیست. از نظر تاریخی، کرایوبیولوژیست‌ها فکر می­کردند که ذوب سریع برای بازیابی بهینه سلول ضروری است. این عقیده با پیشرفت‌های اخیر لغو شده­ است و فقط برای سرعت‌های کاهش دما بسیار سریع که برای سلول‌درمانی قابل ­قبول نیست، قابل استفاده است. بسیاری از افسانه‌ها در مورد گرم­شدن هنوز وجود دارند که احتمالاً به دلایل زیر است:

• فقدان تحقیقات فعال: آخرین مطالعه سیستماتیک روی سلول‌های سوماتیک پستانداران بیش از 30 سال پیش در سال 1979 منتشر شد. در مقابل، در مدت مشابه، حداقل 6 مقاله در مورد میزان گرم­شدن اسپرم‌های فریزشده و حداقل پنج مقاله در مورد نرخ گرم­شدن برای سلول­های جنینی فریز شده منتشر شد.
• استفاده نادرست از داده­های موجود: این فرض وجود دارد که داده­های اسپرم و جنین به سلول­های سوماتیک ترجمه می­شود.
• تاخیر در شستشوی سلول­ها پس از دیفریز: سمیت DMSO می­تواند به سلول­ها پس از ذوب و قبل از شسته­شدن آن آسیب برساند. برخی، روش­های گرم­شدن فیزیکی و شستشوی سلول­ها را به عنوان یک مرحله «دیفریز» در نظر می­گیرند. گاهی اوقات تاخیر در شستشو با ذوب شدن آهسته اشتباه گرفته می­شود.

ذوب مرطوب(استفاده از حمام آب) در طول تقریباً 2 تا 3 دقیقه به راحتی در آزمایشگاه انجام می‌شود. با این حال، این رویکرد سریع در هنگام ذوب سلول­های سوماتیکی که با سرعت دقیق کنترل شده کاهش دما پیدا کرده اند، مورد نیاز نیست.

سرعت گرم­شدن آهسته‌تر به دنبال کاهش دما آهسته برای طیف وسیعی از انواع سلول‌ها آزمایش شده است، که تأثیری بر نتایج پس از ذوب برای سلول‌های کبدی، سلول‌های عصبی، سلول‌های T، سلول‌های تخمدان همستر چینی (CHO)، L cells، آفرزیس فرآوری نشده و لنفوسیت‌ها نشان نمی‌دهد. با کمال تعجب، هیچ مطالعه‌ای نشان نداده است که ذوب سریع برای فرآیندهای سلول‌درمانی/ایمونوتراپی‌ها علیرغم این باور رایج که گرم­شدن سریع مطلوب است، موردنیاز است.

اغلب فرض بر این است که برای جلوگیری از تبلور مجدد یخ در هنگام افزایش دما، دیفریز سریع مورد نیاز است. آثار ذکرشده در بالا نشان داده‌اند که با کاهش دما مناسب و کنترل‌شده در هنگام فریز، تبلور مجدد یخ امکان‌پذیر نیست و این فرض بدون در نظرگرفتن سرعت گرم­شدن در هنگام دیفریز می­باشد.

تشکیل یخ در حین کاهش دما: در طول کاهش دما در فریز، یخ در هسته تشکیل می­شود و از طریق یک سیستم توسعه می­یابد: در ابتدا به صورت کریستال­های دندریتی کوچک و از نظر فیزیکی به صورت سوزن­های ضخیم به هم پیوسته و با جهت­گیری­های مختلف ظاهر می­شوند. با پیشرفت کاهش دما، مولکول‌های آب به کریستال‌های یخ می‌چسبند و اندازه کریستال‌ها افزایش می‌یابد.

این فرآیند منجر به افزایش غلظت اسمزی خارج­ سلولی می­شود که باعث دهیدراته شدن سلول­ها می­شود. اگر کاهش دما با سرعت چند درجه سانتیگراد در دقیقه یا کمتر به آرامی پیش رود، کریستال‌ها زمان کافی برای تشکیل کامل دارند و نمی‌توانند در زمان دیفریز دوباره کریستال شوند.

وقتی کاهش دما خیلی سریع انجام می‌شود، ممکن است مشکلاتی ایجاد شود که از جمله آن آسیب به سلول‌ها است. با کاهش دما سریع، مولکول‌های آب زمان کافی برای چسبیدن به کریستال­های یخ یا خروج از سلول­ها را ندارند.

هنگامی که دما به مرحله انجماد بسیار زیاد (حدود 120- درجه سانتیگراد) می­رسد و دیگر حرکت مولکولی امکان­پذیر نیست، کریستال­ها می­توانند در حالت معلق با ساختاری ناپایدار وجود داشته ­باشند. سپس هنگامی که سیستم گرم شد و گرما دوباره در هنگام ذوب­شدن وارد شد، مولکول­های آب شروع به کار می­کنند تا دوباره به کریستال­‌های یخ بچسبند. این پدیده که به عنوان کریستالیزاسیون مجدد شناخته می­شود، فشار اسمزی قابل توجهی بر سلول­ها وارد می­کند و منجر به آسیب می­شود.

خوشبختانه، سرعت کاهش دما آهسته موردنیاز برای سلول‌درمانی‌های فریزشده و سلول‌های سوماتیکی پستانداران (تا چند درجه در دقیقه) امکان تشکیل کریستال‌های یخ پایدار از نظر ترمودینامیکی را فراهم می‌کند و نیاز به دیفریز سریع را نفی می‌کند. این فرآیند را می­توان از طریق میکروسکوپ سرمایی(cryo-microscopy) بر روی کریستال‌­های یخ در حین سرد شدن و ذوب شدن با سرعت‌های مختلف مشاهده کرد (شکل 2) و مشخص شده است که با نتایج بازیابی سلولی مرتبط است.

یک مطالعه انجمادی میکروسکوپی اخیر نشان ­داد که از دست­دادن قابلیت زنده­مانی با تغییرات در ساختار کریستال یخ در طول افزایش دما مرتبط است. در سرعت­‌های کاهش دما بالا (10- درجه سانتیگراد در دقیقه)، ساختار یخ بسیار بی­شکل به نظر می­رسد. هنگامی که متعاقباً در یک بازه زمانی طولانی‌تر (15 دقیقه یا بیشتر) ذوب شد، تبلور مجدد یخ مشاهده شد که نشان‌دهنده اختلال مکانیکی سلول‌های یخ‌زده است.

خنک شدن در دمای معمولی 1- درجه سانتیگراد در دقیقه منجر به تغییری در ساختار یخ در هنگام گرم­شدن آهسته نمی شود. در مقایسه، گرم­شدن از دمای LN2 (نیتروژن مایع) در دو دقیقه در یک حمام آب منجر به سرعت گرم­شدن حدود 100 درجه سانتیگراد در دقیقه شد.

گرمایش پایدارتر که 10 دقیقه طول می­کشد (مدت فرآیند معمولی برای دستگاه های ذوب خشک) دارای نرخ متوسط گرم­شدن 20 درجه سانتیگراد در دقیقه است. هر دو روش بسیار سریعتر از یک نرخ کاهش دما کنترل شده هستند و در مقایسه با آنچه از نظر فیزیکی و بیولوژیکی توصیه می­شود، سریع در نظر گرفته می‌شوند.

ذوب خشک نمونه‌های کرایوبگ با حجم‌های مختلف که در حدود 1- درجه سانتیگراد در دقیقه سرد شده‌اند، می‌تواند بیشتر از ذوب­شدن در یک حمام آب معمولی طول بکشد، اما منجر به تولید بازده سلولی برابر پس از ذوب می‌شود و ریسک ناهماهنگی مربوط به ذوب مرطوب در حمام آب را از بین می‌برد.

شکل 2. تصاویر انجماد میکروسکوپی گرفته­شده در طول فرآیند انجماد، نشان می­دهد که چگونه تغییرات یخ در طول سردشدن و گرم شدن رخ می­دهد. نمونه‌هایی که دارای برچسب آبی بودند خیلی سریع در حالت انجماد نگهداری شدند، بنابراین یخ در دمای فریز به طور کامل تشکیل نشد (تصویر آبی شماره ۲). ساختار یخ تغییر می­کند (که گاهی اوقات تبلور مجدد نامیده می­شود) در ذوب، درست بعد از تصویر آبی شماره 5.

برعکس، سلول‌هایی که به‌صورت کنترل‌شده سرد می‌شوند (تصاویر نارنجی شماره 1-4) زمان کافی برای تشکیل کریستال‌های یخ بزرگ در هنگام سرد­شدن دارند، بنابراین با گرم­شدن هیچ تبلور مجددی مشاهده نمی‌شود (تصویر نارنجی شماره 5). تبلور مجدد یخ در طول گرم­شدن اتفاق می‌افتد، نه خنک‌شدن – شکل‌های نارنجی نشان می‌دهند که چگونه می‌توان یخ را در هنگام سرد شدن به طور بهینه کنترل کرد تا از تغییر در گرم­شدن جلوگیری ­شود.

سمیت پس از دیفریز: علاوه بر جلوگیری از تغییرات ساختار یخ، به حداقل­ رساندن سمیت برودتی مهم است. در طول انجماد، مواد شیمیایی محافظ انجماد برای محافظت از سلول­ها در برابر آسیب اضافه می­شود که DMSO بیشترین استفاده را برای این منظور دارد. در حالت مایع، این مواد شیمیایی برای سلول­ها سمی هستند و این سمیت در دماهای بالاتر آشکارتر می­شود.

سمیت را می­توان با افزودن یک محافظ انجماد در دمای پایین، چند درجه بالاتر از نقطه انجماد، بلافاصله قبل از فرآیند فریز به حداقل رساند. با این حال، اثرات سمی با دیفریز و افزایش دما از سر گرفته می‌شود.

سمیت مواد محافظ انجماد پس از دیفریز پتانسیل آسیب‌رسانی یکسانی در تمام مراحل مایع چرخه فریز دارد، اما معمولاً نادیده گرفته می‌شود. سلول‌ها اگر بیشتر در هنگام ذوب­شدن به سمیت مواد محافظ انجماد نسبت به هنگام فریز حساس نباشند، حداقل به همان اندازه حساس هستند، به دلیل این واقعیت که قبلاً توسط چرخه فریز/ دیفریز تحت فشار هستند.

به عنوان مثال توصیه می­شود که سلول‌ها را به ترتیب بیش از 30 دقیقه تا 3 ساعت پس از ذوب­شدن در محیط انجماد خود در دمای اتاق (20 درجه تا 25 درجه سانتیگراد) به بیمار تزریق نشود. این محدودیت زمانی شامل هرگونه وقفه در طول انفوزیون می­شود و به حفظ حداکثر زنده­مانی کمک می­کند.

ذوب­ شدن بیش از حد طولانی در حمام آب می­تواند بر بازیابی سلولی تأثیر منفی بگذارد، زیرا به دلیل هدایت حرارتی بالای آب، نمونه­ها به سرعت تا دمای 37 درجه سانتیگراد گرم می­شوند. این فرآیند گرم­شدن سریع می‌تواند شیب‌های حرارتی بزرگی را ایجاد کند، کریستال‌های کوچک یخ می‌توانند در برخی مناطق باقی بمانند، درحالی که مناطق دیگر قبلاً به دمای حمام آب رسیده‌اند. راهبردهای کاهش ذوب مرطوب شامل هم­زدن کیسه در حین گرم­شدن و خارج­کردن آن از حمام آب درست قبل از ذوب­شدن تمام یخ است.

با این حال، چنین اقداماتی برای کاربر خاص هستند و مستعد تغییرات بین نمونه‌ها و دسته‌ها هستند. سیستم‌های ذوب خشک، با اتوماسیون و سرعت ذوب آهسته‌تر، به کاهش آسیب انجماد سلولی کمک می‌کنند و سازگاری بین فرآیندهای ذوب را افزایش می‌دهند.

وقتی سلول­ها دیفریز شدند چه انتظاری باید داشت؟

حذف سلول­ها از سیستم ذوب و شستن محلول محافظ انجماد، پایان چرخه فریز را نشان می­دهد. فریز یک فرآیند پیچیده با پتانسیل تأثیرگذاری قوی بر سلول­ها است. همانطور که در شکل 3 نشان داده ­شده­ است، مهم است که تأثیر زمان بر آسیب سلولی پس از ذوب را در نظر بگیرید تا به درستی تأثیر کلی سیستم بیولوژیکی را درک ­کنید.

برخی از اثرات چرخه فریز را می­توان بلافاصله مشاهده کرد، در حالی که توسعه برخی دیگر به زمان نیاز دارد. این فاکتور زمان یک ملاحظه کلیدی در استفاده گسترده از سلول­درمانی است. مرگ سلولی به دنبال انجماد را می­توان بر­اساس نوع مرگ نکروز و آپوپتوز طبقه­بندی کرد.

مرگ نکروز شامل سلول‌هایی است که بلافاصله در طی فرآیند فریز از بین می‌روند و سلول‌هایی که به طور کامل از سیستم از بین می‌روند، چه از طریق مراحل شستشو یا از لیز کامل. این سلول‌های «مفقودشده» معمولاً در سنجش­های زنده‌مانی نشان نمی‌دهند زیرا از سیستم حذف شده‌اند، اما با تفاوت در تعداد سلول‌ها قبل از فریز و پس از دیفریز قابل تشخیص هستند.

مرگ سلولی در اثر آپوپتوز از چند ساعت تا 2 تا 3 روز پس از دیفریز رخ می­دهد (شکل 3)، بنابراین اندازه­گیری زنده­مانی بلافاصله پس از اتمام فریز می­تواند نتایج مثبت نادرستی به همراه داشته باشد. این سلول­ها آسیب می­بینند و در صورتی که این آسیب قابل ترمیم نباشد دچار آپوپتوز می­شوند. حذف سلول‌ها از محیط کشت سلولی، سرعت عملکرد و متابولیک آنها را نیز کاهش می‌دهد.

این پدیده می­تواند پس از انجماد قابل توجه باشد، بنابراین ما انجام تست­های عملکردی خاص فراتر از تعداد سلول و زنده­مانی پس از دیفریز را توصیه می­کنیم.

پس از دیفریز آزمایش با رنگ­آمیزی تریپان­بلو سریع، آسان، تثبیت­شده و ارزان است. این رنگ به تعیین نفوذپذیری غشای سلولها کمک می­کند که مستقیما با مرگ سلولی در ارتباط است. با این حال، سلول‌هایی که از نظر عملکردی مرده هستند، هنوز می‌توانند در زمان انجام آزمایش یک غشای سالم داشته باشند که منجر به نتایج مثبت کاذب می‌شود. تریپان بلو همچنین می‌تواند برای شمارش سلول‌ها برای بدست­آوردن زنده­مانی سلول­ها استفاده شود.

سایر آزمایش‌های ساده شامل سنجش‌های مبتنی بر کاهش است که در آن از نشانگرهایی مانند فلورسین دی استات، معرف alamarBlue، معرف PrestoBlue و MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) برای تعیین متابولیسم سلول استفاده می‌شود. این سنجش‌ها دقیق‌تر هستند و نسبت به موارد مثبت کاذب حساسیت کمتری دارند، اگرچه اغلب به یک دوره انکوباسیون نیاز دارند که به پیچیدگی فرآیند می‌افزاید.

افزایش پیچیدگی، آزمایش‌های تکثیر، آزمایش‌های نشانگر آپوپتوز، و سنجش‌های عملکردی خاص برای استفاده مورد نظر سلول در داخل بدن، مانند توانایی سلول‌های NK یا T برای هدف قرار دادن سلول‌های سرطانی که نشانگر خاصی را بیان می‌کنند، هستند. قبل از تجویز بیمار انجام می­شود، اما به ندرت در کلینیک امکان­پذیر است. بنابراین، محدودیت­های تست های زنده­مانی فوری باید به وضوح درک شود.

شکل 3. شماتیک سلول­ها در طول کاهش دما، دیفریز و پس از دیفریز. یخ در اطراف سلول­ها تشکیل می­شود و در طول کاهش دما کنترل شده منبسط می­شود و در حین دیفریز آهسته و سریع پایدار می‌ماند. پس از دیفریز، برخی از سلول­ها آسیب می­بینند و بقایای سلولی را تشکیل می­دهند درحالی که برخی دیگر چند روز پس از دیفریز تحت آپوپتوز قرار می­گیرند، باقیمانده زنده خواهند­ ماند، زیرا به طور موثری در سرما نگهداری شده ­اند.

خلاصه و نتیجه­‌گیری

درگذشته، دیفریز، کمترین بخش تحت کنترل و گام ثابت چرخه‌های انجماد فریز بود. اخیراً، سیستم‌های ذوب خشک برای کاهش مشکلات مرتبط با فرآیندهای کنترل نشده و آلودگی دردسترس قرارگرفته‌اند، و ذوب، سلول‌درمانی سازگار و بهینه را ارائه می‌دهند.

علم ساختارهای یخی و چگونگی تغییر آنها در طول سردشدن و گرم­ شدن نیز امروزه بهتر درک شده ­است. کاهش دما آهسته و دقیقاً کنترل‌شده، در حالی که برای سلول‌درمانی ضروری است، دامنه قابل­ قبول‌تری از نرخ‌های ذوب را نیز امکان‌پذیر می‌کند.

هنگام ارزیابی زنده‌­مانی پس از دیفریز، مهم است که اطمینان حاصل شود که سنجش‌های مناسب با در نظر گرفتن استحکام این سنجش‌ها و همچنین عملی­ بودن درمان اعمال می‌شوند.

این پیشرفت‌ها با هم به کنترل بهتر، دقیق‌تر و مداوم فرآیندهای دیفریز کمک کرده‌اند که منجر به ارائه مطمئن‌تر درمان‌های مؤثر به بیماران می‌شود.

برگرفته از:

https://www.cytivalifesciences.com.cn/zh/cn/solutions/cell-therapy/knowledge-center/resources/a-guide-to-cell-thawing