سرفصل های دوره کارآموی ایمونواسی

تکنیک الایزا و انواع آن

 روش سنجش ایمنی متصل به آنزیم Enzyme-linked immunosorbent assay  

(ELISA) پر کاربرد ترین تکنیک ایمونواسی است و همانطور که از نام آن مشخص است آنتی بادی شناساگر به آنزیم متصل شده است. از این تکنیک  به طور گسترده در آزمایشگاه های تحقیقاتی و تشخیص طبی استفاده می شود. با تعریف دقیق، شامل هرگونه ایمنی سنجی فاز جامد کوت شده با آنتی بادی و یا آنتی ژن و حضور یک آنزیم درگیر در فرآیند تولید سیگنال می باشد. از آنجا که یک مولکول آنزیم میتواند تعداد زیادی مولکول سوبسترا را تبدیل کند تولید سیگنال بسیار شدت می یابد. انکوباتورها ، دستگاه های شستشو و اسپکتروفتومترها در مقیاس آزمایشگاهی یک بستر انعطاف پذیر و ارزان با حساسیت و ویژگی بالا برای شناسایی طیف وسیعی از آنالیت ها ارائه می دهند. توانایی تکنیک الایزا  برای ارائه تستهای ارزان و قابل اعتماد برای غربالگری تعداد زیادی نمونه ، آن را به یک روش مطلوب برای  محققانی که در بودجه های محدود کار می کنند تبدیل کرده است. از تکنیک الایزا  برای تشخیص و تعیین مقدار آنتی ژن ها ، آنتی بادی ها ، هورمون ها و سایر مولکول ها استفاده می شود. علاوه بر برنامه های کاربردی در تشخیص بالینی ، از آن به عنوان روش سنجش اختصاصی برای بسیاری از اهداف تحقیقاتی ، مانند توصیف پروتئین ها و داروهای جدید استفاده می شود. معمولا الایزا در پلیت های ۹۶ خانه از جنس پلی استرین انجام می شود.مراحل کار به طور خلاصه  به این صورت که در کف پلیت آنتی ژن یا آنتی بادی مکمل آنالیت مورد نظر کوت شده است. سپس نمونه  به هر چاهک اضافه می شود. بعد از اضافه کردن نمونه شستشو انجام می شود تا آنتی ژن یا آنتی بادی هایی که متصل نشده اند از محیط خارج شوند. سپس آنتی بادی نشاندارشده با آنزیم اضافه می شود و مجددا شستشو انجام می شود. آخرین مرحله اضافه کردن سوبسترای آنزیم و دیدن رنگ تولید شده است. پلیت با دستگاه الایزا ریدر خوانده می شود. شدت رنگ تولید شده نشانگر غلظت آنالیت مورد نظر است.

انواع الایزا:

بسته به هدف و نوع آنالیت مورد سنجش انواع مختلف الایزا طراحی شده اند.

  • الایزای مستقیم

در این روش آنتی ژن در کف چاهک های پلیت کوت شده است و به طور مستقیم با آنتی بادی نشاندار شده شناسایی می شود.این روش برای زمانی مناسب است که کیت مورد نظر شما برای شناسایی پروتئین هدف موجود نباشد.

مزایا:

  • سریع است زیرا فقط یک آنتی بادی استفاده می شود و مراحل کمتری دارد.
  • مشکل واکنش متقاطع آنتی بادی ثانویه حذف می شود

         معایب:

  • قدت واکنشگری ایمنی آنتی بادی اولیه ممکن است تحت تاثیرلیبل شدن با آنزیم قرار بگیرد
  • لیبل کردن آنتی بادی های اولیه برای هر واکنش اختصاصی الیزا وقت گیر و پر هزینه است.
  • عدم انعطاف پذیری در انتخاب لیبل آنتی بادی اولیه از آزمایش به آزمایش دیگر.
  • سیگنال به اندازه کافی تقویت نمی شود.

2- الایزای غیر مستقیم

برای تشخیص غیرمستقیم ، آنتی ژن کوت شده به ته چاهک در دو مرحله یا لایه تشخیص داده می شود. ابتدا آنتی بادی اولیه بدون لیبل ، که مخصوص آنتی ژن است ، اعمال می شود. بعد ، آنتی بادی ثانویه که آنزیم به آن کونژوگه است به اولین آنتی بادی متصل می شود. آنتی بادی ثانویه معمولاً یک آنتی بادی ضد گونه است و غالباً پلی کلونال است. روش غیرمستقیم ، محبوب ترین قالب برای الایزا است.

  مزایا:

  • طیف گسترده ای از آنتی بادی های ثانویه دارای لیبل به صورت تجاری در دسترس هستند.
  • چند منظوره است زیرا بسیاری از آنتی بادی های اولیه را می توان در یک گونه تهیه کرد وازهمان آنتی بادی ثانویه که لیبل دارد برای تشخیص استفاده کرد.
  • قدرت اتصال به آنتی ژن آنتی بادی اولیه حفظ می شود زیرا برچسب گذاری نشده است.
  • حساسیت افزایش می یابد زیرا هر آنتی بادی اولیه شامل چندین اپی توپ است که آنتی بادی ثانویه دارای برچسب می تواند به آن متصل شود و تقویت سیگنال را امکان پذیر می سازد.

معایب:

  • واکنش متقابل ممکن است با آنتی بادی ثانویه رخ دهد ، و منجر به سیگنال غیر اختصاصی شود.
  • یک مرحله انکوباسیون اضافی در این روش لازم است.

الایزای ساندویچ

الایزای ساندویچ به طور معمول نیاز به استفاده از جفت آنتی بادی های همسان ، جایی که هر آنتی بادی برای یک قسمت مختلف و غیر همپوشان (اپی توپ) از مولکول آنتی ژن اختصاصی است. اولین آنتی بادی (معروف به آنتی بادی گیرنده) به چاه ها پوشانده می شود. سپس  نمونه به چاهک اضافه می شود. آنتی بادی دوم (معروف به آنتی بادی تشخیصی) که به آنزیم کونژوگه است برای اندازه گیری غلظت نمونه استفاده می شود.

 مزایا:

  • اختصاصیت بالا: آنتی ژن / آنالیت به طور خاص ضبط و شناسایی می شود
  • مناسب برای نمونه های پیچیده (یا خام / ناخالص): آنتی ژن قبل از اندازه گیری نیازی به تصفیه ندارد
  • انعطاف پذیری و حساسیت: هر دو روش تشخیص مستقیم یا غیرمستقیم قابل استفاده هستند

الایزای رقابتی

قسمت اصلی الایزای رقابتی (همچنین به عنوان  مهار کننده نیز شناخته می شود) روند واکنش رقابتی بین آنتی ژن نمونه و آنتی ژن متصل به چاهک های یک صفحه میکروتیتر با آنتی بادی اولیه است. ابتدا ، آنتی بادی اولیه با نمونه انکوبه می شود و کمپلکس های آنتی بادی-آنتی ژن حاصل به چاهک هایی که با همان آنتی ژن پوشیده شده اند اضافه می شود. پس از یک دوره انکوباسیون هر آنتی بادی که متصل نشده باشد شسته می شود. هرچه آنتی ژن در نمونه بیشتر باشد ، آنتی بادی اولیه به آنتی ژن نمونه متصل خواهد شد. بنابراین مقدار کمتری از آنتی بادی اولیه برای اتصال به آنتی ژن پوشش داده شده روی چاهک در دسترس خواهد بود و در نتیجه کاهش سیگنال ایجاد می شود.

مزایا

  • مزیت اصلی این نوع الایزا حساسیت بالای آن در برابر تفاوت های ترکیبی در مخلوط های آنتی ژن پیچیده است ، حتی زمانی که آنتی بادی تشخیص دهنده خاص در مقادیر نسبتاً کمی وجود دارد.

مقایسه مراحل کلیدی در روش های متفاوت الایزا

تکنیک الایزا و انواع آن
تکنیک الایزا و انواع آن
تکنیک الایزا و انواع آن
تکنیک الایزا و انواع آن