توالی یابی پک بیو (PacBio) چیست؟
توالی یابی پک بیو، همچنین به عنوان توالی یابی مولکول منفرد در زمان واقعی Real-time (SMRT) شناخته می شود، نوعی روش توالی یابی نسل سوم است که توسط شرکت پاسیفیک بایوساینسز (Pacific Biosciences) توسعه یافته و امکان مشاهده‌ی ریل تایم سنتز DNA بدون نیاز به تکثیر DNA را فراهم می‌کند.
توالی یابی پک بیو (PacBio) یک فناوری توالی یابی با خوانش طولانی (long-read) است که خوانش‌هایی با طول ده‌ها کیلوبیس تولید می‌کند. توالی یابی پک بیو می‌تواند خوانش‌های طولانی و بسیار دقیق DNA تولید کند که در مطالعه مناطق پیچیده ژنومی که برای سایر فناوری‌های توالی یابی دشوار هستند، مفید است. این فناوری کاربردهای ژنومی مختلفی از جمله مونتاژ ژنوم از ابتدا، تشخیص واریانت و مطالعه تغییرات اپی ژنتیکی دارد.
پک بیو در طول سال‌ها سیستم‌های توالی یابی مختلفی را توسعه داده است که از PacBio RS آغاز شده و به سیستم‌های Sequel پیشرفته‌تر تبدیل شده است.
اصل توالی یابی پک بیو
توالی یابی پک بیو بر اساس اصل مشاهده در لحظه تکثیر DNA با استفاده از تراشه SMRT و سیگنال‌های فلورسانس کار می‌کند. این فناوری از یک الگوی DNA حلقوی تخصصی به نام SMRTbell استفاده می‌کند که دارای آداپتورهای سنجاق سری (hairpin) در هر دو انتها است. الگو روی یک تراشه توالی یابی تخصصی به نام SMRT سل بارگذاری می‌شود که حاوی هزاران چاهک کوچک به نام موج‌برهای حالت صفر (zero-mode waveguides) (ZMW) است.
توالی یابی پک بیو (PacBio) با استخراج مواد ژنتیکی از هر نوع نمونه آغاز می‌شود که سپس با اتصال آداپتورهای hairpin به هر دو انتهای DNA دو رشته‌ای، به کتابخانه SMRTbell تبدیل می‌شود و یک الگوی حلقوی تشکیل می‌دهد. پرایمرها و پلیمراز به این کتابخانه اضافه می‌شوند که روی دستگاه توالی یابی حاوی SMRT سل و ZMW بارگذاری می‌شود. یک رشته DNA منفرد در هر ZMW ثابت می‌شود. با افزودن نوکلئوتیدهای دارای برچسب فلورسانس توسط پلیمر به رشته DNA در حال رشد، نور ساطع می‌شود. این انتشار نور بصورت real-time اندازه‌گیری می‌شود و این سیگنال‌ها به توالی نوکلئوتیدی تبدیل می‌شوند.
مراحل توالی یابی پک بیو
فرآیند توالی یابی پک بیو (PacBio) به چهار مرحله زیر تقسیم می‌شود:
- آماده‌سازی نمونه: آماده‌سازی نمونه شامل جداسازی DNA از نمونه‌های زیستی مورد نظر است. DNA مورد نظر با استفاده از روش‌های شیمیایی و مکانیکی مختلف استخراج می‌شود. سلول‌ها برای استخراج DNA لیز می‌شوند و سپس برای حذف هرگونه آلودگی خالص‌سازی می‌شوند.
- ساخت کتابخانه: مرحله بعدی ساخت کتابخانه است که شامل چندین مرحله برای آماده‌سازی DNA برای توالی‌یابی می‌شود. در ابتدا، DNA ژنومی استخراج‌شده به قطعاتی با اندازه دلخواه برش داده می‌شود و تحت تعمیر (ترمیم) انتهایی قرار می‌گیرد. سپس، آداپتورهای دارای ساختار مویی سنجاق سری به هر دو انتهای قطعات DNA متصل می‌شوند که ساختارهای حلقوی تک رشته‌ای به نام الگوهای SMRTbell را ایجاد می‌کنند. در نهایت، الگوها خالص‌سازی شده و روی دستگاه توالی‌یابی پک بیو (PacBio) بارگذاری می‌شوند.
توالی‌یابی پک بیو، الگوی SMRTbell
- توالی‌یابی: واکنش توالی‌یابی از الگوهای SMRTbell و SMRT سل استفاده می‌کند. در ابتدا، هر الگوی SMRTbell در هر ZMW در SMRT سل قرار می‌گیرد. رشته DNA الگو و DNA پلیمر در باز ZMW ثابت می‌شوند. سپس، نوکلئوتیدهای دارای برچسب فلورسانس به ZMW وارد می‌شوند. نور لیزر از باز ZMW عبور می‌کند. پلیمر هنگام افزودن یک نوکلئوتید مکمل به رشته DNA یک سیگنال فلورسانس تولید می‌کند. این سیگنال با استفاده از دوربین CCD در real-time ثبت می‌شود. این فرآیند برای آشکارسازی توالی هر باز در الگوی SMRTbell تکرار می‌شود.
- تحلیل داده: پس از توالی‌یابی، داده‌ها با استفاده از ابزارهای مختلف بیوانفورماتیک تحلیل می‌شوند. اولین مرحله در تحلیل داده‌ها، تعیین باز است که داده‌های خام را به توالی‌های نوکلئوتیدی تبدیل می‌کند. در توالی‌یابی پک بیو (PacBio)، این شامل ترجمه سیگنال‌های فلورسانس به توالی‌های باز است. این منجر به یک خوانش طولانی پیوسته (CLR) می‌شود که سپس برای ایجاد خوانش‌های HiFi با استفاده از توالی‌یابی توافق حلقوی (CCS) به زیرخوانش‌ها تقسیم می‌شود. سپس از ابزارهای مختلف برای بررسی کیفیت داده‌های پک بیو استفاده می‌شود. مرحله بعدی هم‌ترازی و مونتاژ به توالی‌های پیوسته است. پس از تکمیل مونتاژ، آنتولوژی برای شناسایی ساختار و عملکرد ژنها در توالی مونتاژ شده انجام می‌شود.
انواع داده‌های توالی یابی پک بیو
- خوانش‌های طولانی پیوسته (Continuous Long Reads)(CLRs) خوانش‌های خام و پردازش نشده هستند که از توالی‌یابی تک پاس الگوهای DNA حلقوی در توالی‌یابی پک بیو (PacBio) تولید می‌شوند.
آن‌ها طول خوانش طولانی را ارائه می‌دهند اما ممکن است دارای نرخ خطای بالاتری باشند.
CLRها با استفاده از اینسرت‌های DNA با اندازه بزرگ برای ساخت الگوهای SMRTbell تولید می‌شوند. به دلیل اندازه بزرگ اینسرت (large insert size)، پلیمر فقط یک بار از الگو عبور می‌کند.
- توالی‌یابی توافق حلقوی (Circular Consensus Sequencing)(CCS) چندین بار همان الگوی DNA حلقوی را توالی‌یابی می‌کند تا چندین خوانش از یک توالی یکسان تولید کند و یک توالی توافقی با دقت بالا تولید کند. زیرخوانش‌ها از چندین پاس برای تولید یک توالی توافقی ترکیب می‌شوند. CCS برای تولید خوانش‌های با دقت بالا (HiFi) استفاده می‌شود که داده‌های با دقت بالا و خوانش طولانی را ارائه می‌دهند. از اینسرت‌های DNA کوچکتر برای مونتاژ در الگوهای SMRTbell استفاده می‌کند که به پلیمر اجازه می‌دهد چندین بار از الگو عبور کند. CCS برای افزایش دقت توالی‌یابی با تولید یک توالی توافقی (consensus sequence) با دقت بالا استفاده می‌شود.
نکته مترجم: توافقی در زمینه توالی یابی CCS به معنی رسیدن به یک توافق جمعی یا consensus در مورد توالی صحیح یک باز خاص در یک موقعیت مشخص در DNA است. مثلا توی الاین کردن ژنهای مختلف که سنگر میشند، در نهایت یک consensus میده که از کنارهم قرار دادن اون ژنها، یک ژن با توالی اونها بدست میاره که میگند اصطلاحا برایند سنگرسکوئنسینگ اون ژنها این consensus است.
همچنین بخوانید:
- مروری بر توالی یابی نسل بعد، کاربردها و انواع آن (بررسی پلت فرم ها)
- NGS چیست؟
- توالی یابی DNA به روش سنگر + ویدیو آموزشی
مترجم: محمد صادق محمودی لرد
