فهرست مطالب
نمایش
مقدمه
ایسترن بلات یک تکنیک بیولوژی مولکولی است که برای تشخیص ویرایش پساترجمه (Post-translational modification) در پروتئینها و وجود اجزایی مانند لیپیدها (Lipid) و کربوهیدراتها استفاده میشود.
- ایسترن بلات به عنوان توسعهای بر روشی رایجتر به نام وسترن بلات (Western blot) کشف شد.
- ایسترن بلات در درجه اول برای تشخیص حضور بیومولکولها در پروتئینهای مختلف انجام میشود که میتوان از آن برای مطالعه تفاوتها در ویرایش پساترجمه در گونههای مختلف استفاده کرد.
- اصول و پروسه انجام در تمام تکنیکهای بلات مشابه است. با این حال، مولکول یا ذرهای که باید شناسایی شود ممکن است متفاوت باشد.
- ایسترن بلات اندکی اصلاح شده است تا شکل جدیدی از تکنیک بلات به نام Far-Western blotting را ایجاد کند که برای مطالعه لیپیدهای جدا شده توسط روش کروماتوگرافی (Chromatography)، استفاده میشود.
اصول ایسترن بلات
- اصول ایسترن بلات مشابه اصول سایر تکنیکهای بلات است.
- ایسترن بلات یک روش ایمونوبلات (Immunoblot) است که به برهمکنش خاص بین پروتئین مورد نظر و یک پروب به منظور شناسایی بیومولکول مورد نظر در مخلوطی از مولکولهای مختلف، بستگی دارد.
- در مورد ایسترن بلات، پروتئینها روی ژل پلیکریلآمید (Polyacrylamide)، الکتروفورز (Electrophorese) شده تا از مخلوط جدا شوند.
- سپس پروتئینها به غشای نیتروسلولزی (Nitrocellulose) یا نایلونی (Nylon) منتقل میشوند، یعنی جایی که مولکولهای هدف از طریق برهمکنش خاص آنها با پروبها، شناسایی میشوند.
- شناسایی برهمکنش را میتوان از طریق استفاده از یک پروب رادیواکتیو یا با استفاده از یک مولکول برچسبدار ثانویه همانند مولکولی که در تست ELISA به کار میرود، انجام داد.
- ایسترن بلات مانند سایر تکنیکهای بلات، بر اساس برهمکنشهای آنتیژن- آنتیبادی است که در آن ویژگی و میزان برهمکنش نتیجه را تعیین میکنند.
- ایسترن بلات شبیه لکتین بلات (Lectin blot) است زیرا هر دوی آنها در درجه اول برای شناسایی اپیتوپهای (Epitope) کربوهیدراتی روی پروتئینها و لیپیدها استفاده میشوند.
- استفاده از ایسترن بلات برای شناسایی ترکیبات مولکولی کوچکتر ضروری است، زیرا شناسایی این مولکولها با روش رنگآمیزی ایمونولوژیک (Immunostaining) امکان پذیر نیست.
نیازمندیها
موارد زیر جزء نیازمندیهای ایسترن بلات هستند:
- پلیت کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography Plate)
- غشای انتقال
- محلول NaIO4
- محلول بلاتینگ
- Na2CO3/ NaHCO3
- پلیت فولادی ضد زنگ
روش ایسترن بلات
- پلیت TLC ایجاد شده پس از کروماتوگرافی با غشای PVDF پوشانده میشود تا محتویات از پلیت به غشاء با فشار یا حرارت منتقل شود.
- انتقال اجزاء از پلیت TLC به غشاء را نیز میتوان با عبور دادن جریان الکتریکی از ساختار، به دست آورد.
- سپس غشاء با سدیم پریودید (Sodium periodide) ترکیب میشود تا اجزاء روی غشا ثابت شوند. سپس به مدت 1 ساعت در محلول انکوبه و با آب شسته میشود.
- غشاء در محلول BSA در شرایط قلیایی (بافر Na2CO3/ NaHCO3) غوطهور میشود تا مزدوج هاپتن-BSA (Hapten-BSA conjugate) روی غشا آماده شود.
- غشا با 5% شیر بدون چربی/ PBS به مدت 3 ساعت مهار شده و با PBS شسته میشود. غشاء با MAb ترکیب میشود که سبب شناسایی هاپتن میگردد.
- برهمکنش بین MAb و هاپتن اساس ایسترن بلات را برای شناسایی بیومولکولها تشکیل میدهد.
- پس از آن، MAb را میتوان با افزودن یک آنتیبادی ثانویه لیبلدار با پراکسیداز (Peroxidase) شناسایی کرد.
- در نهایت یک سوبسترا به غشاء اضافه میشود که از طریق رنگآمیزی به تصویرسازی آنتیبادی ثانویه کمک میکند.
تفسیر نتایج
- نتیجه ایسترن بلات به نوع برچسب استفاده شده در آنتیبادی ثانویه بستگی دارد.
- نتیجه مثبت با ظهور رنگ یا رادیواکتیویته مشخص میشود.
- نتیجه منفی با فقدان رنگ یا رادیواکتیویته مشخص میشود.
کاربردها
- مهمترین کاربرد ایسترن بلات، آنالیز ویرایش پساترجمه در پروتئینها است.
- از این تکنیک برای شناسایی و خالصسازی محصولات مختلف گیاهی استفاده میشود.
- این تکنیک همچنین امکان تشخیص تغییرات در پروتئینها با منشأ مختلف را فراهم میکند.
- همچنین به مطالعه ماهیت برهمکنشهای بین مولکولهای مختلف با استفاده از لیگاندها (Ligand) کمک میکند.
- ایسترن بلات به طور گستردهای برای مقایسه تغییرات در پروتئینهای به دست آمده از گونههای مختلف باکتریایی استفاده میشود.
- همچنین برای شناسایی اپیتوپهای کربوهیدرات در پروتئینهای مختلف استفاده میشود.
محدودیتها
- این تکنیک پیچیده و شامل مراحل متعددی است که مستعد خطا هستند. همچنین برای استفاده به پرسنل آموزش دیده نیاز دارد.
- این تکنیک نیاز به استفاده از مقدار قابل توجهی از نمونه دارد، که ممکن است در مورد محصولاتی که بازده کمی دارند، مشکلساز باشد.
- تعیین خاصیت دقیق پروتئینها و مولکولهای زیستی با ایسترن بلات دشوار است.
- در برخی موارد، برهمکنش بین پروب و مولکولهای زیستی ممکن است منجر به تخریب ساختار سوم پروتئین شود.
همچنین مطالب بیشتری بخوانید:
- ساترن بلاتینگ (Southern Blotting) چیست؟
- ایمونوبلاتینگ چیست؟
- آموزش آنالیز داده های وسترن بلات با نرم افزار image J
- وسترن بلات (western blot) چیست؟
- آموزش کامل تکنیک SDS-PAGE
مترجم: صادق حسینیکیا