ایسترن بلات (Eastern Blot): تعریف، اصول، مراحل، نتایج و کاربردها

ایسترن بلات (Eastern Blot): تعریف، اصول، مراحل، نتایج و کاربردها

مقدمه

ایسترن بلات یک تکنیک بیولوژی مولکولی است که برای تشخیص ویرایش پساترجمه (Post-translational modification) در پروتئین‌ها و وجود اجزایی مانند لیپیدها (Lipid) و کربوهیدرات‌ها استفاده می‌شود.

  • ایسترن بلات به عنوان توسعه‌ای بر روشی رایج‌تر به نام وسترن بلات (Western blot) کشف شد.
  • ایسترن بلات در درجه اول برای تشخیص حضور بیومولکول‌ها در پروتئین‌های مختلف انجام می‌شود که می‌توان از آن برای مطالعه تفاوت‌ها در ویرایش پساترجمه در گونه‌های مختلف استفاده کرد.
  • اصول و پروسه انجام در تمام تکنیک‌های بلات مشابه است. با این حال، مولکول یا ذره‌ای که باید شناسایی شود ممکن است متفاوت باشد.
  • ایسترن بلات اندکی اصلاح شده است تا شکل جدیدی از تکنیک بلات به نام Far-Western blotting را ایجاد کند که برای مطالعه لیپیدهای جدا شده توسط روش کروماتوگرافی (Chromatography)، استفاده می‌شود.

اصول ایسترن بلات

  • اصول ایسترن بلات مشابه اصول سایر تکنیک‌های بلات است.
  • ایسترن بلات یک روش ایمونوبلات (Immunoblot) است که به برهم‌کنش خاص بین پروتئین مورد نظر و یک پروب به منظور شناسایی بیومولکول مورد نظر در مخلوطی از مولکول‌های مختلف، بستگی دارد.
  • در مورد ایسترن بلات، پروتئین‌ها روی ژل پلی‌‌کریل‌آمید (Polyacrylamide)، الکتروفورز (Electrophorese) شده تا از مخلوط جدا شوند.
  • سپس پروتئین‌ها به غشای نیتروسلولزی (Nitrocellulose) یا نایلونی (Nylon) منتقل می‌شوند، یعنی جایی که مولکول‌های هدف از طریق برهم‌کنش خاص آن‌ها با پروب‌ها، شناسایی می‌شوند.
  • شناسایی برهم‌کنش را می‌توان از طریق استفاده از یک پروب رادیواکتیو یا با استفاده از یک مولکول برچسب‌دار ثانویه همانند مولکولی که در تست ELISA به کار می‌رود، انجام داد.
  • ایسترن بلات مانند سایر تکنیک‌های بلات، بر اساس برهمکنش‌های آنتی‌ژن- آنتی‌بادی است که در آن ویژگی و میزان برهمکنش نتیجه را تعیین می‌کنند.
  • ایسترن بلات شبیه لکتین بلات (Lectin blot) است زیرا هر دوی آن‌ها در درجه اول برای شناسایی اپی‌توپ‌های (Epitope) کربوهیدراتی روی پروتئین‌ها و لیپیدها استفاده می‌شوند.
  • استفاده از ایسترن بلات برای شناسایی ترکیبات مولکولی کوچکتر ضروری است، زیرا شناسایی این مولکول‌ها با روش رنگ‌آمیزی ایمونولوژیک (Immunostaining) امکان پذیر نیست.

ایسترن بلات (Eastern Blot): تعریف، اصول، مراحل، نتایج و کاربردها

نیازمندی‌ها

موارد زیر جزء نیازمندی‌های ایسترن بلات هستند:

  • پلیت کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography Plate)
  • غشای انتقال
  • محلول NaIO4
  • محلول بلاتینگ
  • Na2CO3/ NaHCO3
  • پلیت فولادی ضد زنگ

روش ایسترن بلات

  • پلیت TLC ایجاد شده پس از کروماتوگرافی با غشای PVDF پوشانده می‌شود تا محتویات از پلیت به غشاء با فشار یا حرارت منتقل شود.
  • انتقال اجزاء از پلیت TLC به غشاء را نیز می‌توان با عبور دادن جریان الکتریکی از ساختار، به دست آورد.
  • سپس غشاء با سدیم پریودید (Sodium periodide) ترکیب می‌شود تا اجزاء روی غشا ثابت شوند. سپس به مدت 1 ساعت در محلول انکوبه و با آب شسته می‌شود.
  • غشاء در محلول BSA در شرایط قلیایی (بافر Na2CO3/ NaHCO3) غوطه‌ور می‌شود تا مزدوج هاپتن-BSA (Hapten-BSA conjugate) روی غشا آماده شود.
  • غشا با 5% شیر بدون چربی/ PBS به مدت 3 ساعت مهار شده و با PBS شسته می‌شود. غشاء با MAb ترکیب می‌شود که سبب شناسایی هاپتن می‌گردد.
  • برهم‌کنش بین MAb و هاپتن اساس ایسترن بلات را برای شناسایی بیومولکول‌ها تشکیل می‌دهد.
  • پس از آن، MAb را می‌توان با افزودن یک آنتی‌بادی ثانویه لیبل‌دار با پراکسیداز (Peroxidase) شناسایی کرد.
  • در نهایت یک سوبسترا به غشاء اضافه می‌شود که از طریق رنگ‌آمیزی به تصویرسازی آنتی‌بادی ثانویه کمک می‌کند.

تفسیر نتایج

  • نتیجه ایسترن بلات به نوع برچسب استفاده شده در آنتی‌بادی ثانویه بستگی دارد.
  • نتیجه مثبت با ظهور رنگ یا رادیواکتیویته مشخص می‌شود.
  • نتیجه منفی با فقدان رنگ یا رادیواکتیویته مشخص می‌شود.

کاربردها

  • مهمترین کاربرد ایسترن بلات، آنالیز ویرایش پساترجمه در پروتئین‌ها است.
  • از این تکنیک برای شناسایی و خالص‌سازی محصولات مختلف گیاهی استفاده می‌شود.
  • این تکنیک همچنین امکان تشخیص تغییرات در پروتئین‌ها با منشأ مختلف را فراهم می‌کند.
  • همچنین به مطالعه ماهیت برهمکنش‌های بین مولکول‌های مختلف با استفاده از لیگاندها (Ligand) کمک می‌کند.
  • ایسترن بلات به طور گسترده‌ای برای مقایسه تغییرات در پروتئین‌های به دست آمده از گونه‌های مختلف باکتریایی استفاده می‌شود.
  • همچنین برای شناسایی اپی‌توپ‌های کربوهیدرات در پروتئین‌های مختلف استفاده می‌شود.

کاربردهای ایسترن بلات

محدودیت‌ها

  • این تکنیک پیچیده و شامل مراحل متعددی است که مستعد خطا هستند. همچنین برای استفاده به پرسنل آموزش دیده نیاز دارد.
  • این تکنیک نیاز به استفاده از مقدار قابل توجهی از نمونه دارد، که ممکن است در مورد محصولاتی که بازده کمی دارند، مشکل‌ساز باشد.
  • تعیین خاصیت دقیق پروتئین‌ها و مولکول‌های زیستی با ایسترن بلات دشوار است.
  • در برخی موارد، برهمکنش بین پروب و مولکول‌های زیستی ممکن است منجر به تخریب ساختار سوم پروتئین شود.

همچنین مطالب بیشتری بخوانید:

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه

5 / 5. تعداد رای دهندگان: 1

تا حالا امتیازی برای این مطلب ثبت نشده؛ با ثبت نظرتون مارو خوشحال می‌کنید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *