اولتراسانتریفیوژ: اصول، انواع، قطعات و کاربرد

فهرست مطالب نمایش

اولتراسانتریفیوژ چیست؟

اولتراسانتریفیوژ یک سانتریفیوژ پیشرفته است که با سرعت بسیار بالا کار می‌کند و مولکول‌های کوچکتری را که نمی‌توان با سانتریفیوژهای سنتی جدا کرد، جدا می‌کند.
سرعت روتورها آن‌ها می‌تواند از 60000 دور در دقیقه تا 150000 دور در دقیقه باشد.
اولتراسانتریفیوژها عمدتاً در آزمایشگاه‌های مجهز برای انجام عملیات پیشرفته‌تر به کار می‌رود.
این‌ها از نظر اندازه بزرگتر هستند و می‌توانند نمونه‌ها را به صورت دسته‌ای جدا کرده یا به عنوان یک سیستم جریان پیوسته کار کنند.
اکثر این دستگاه ها به منظور کنترل گرمایی که ممکن است به دلیل سرعت بیش از حد تولید شود در یخچال نگهداری می‌شوند.

اصول کار

اولتراسانتریفیوژ مانند همه سانتریفیوژهای دیگر کار می‌کند.
کار این دستگاه بر اساس اصل ته نشینی است. بدین صورت است که ذرات متراکم‌تر در مقایسه با ذرات کم تراکم تحت نیروی گرانش، سریع‌تر ته نشین می‌شوند.
با این حال، ته نشین شدن ذرات تحت گرانش زمان بیشتری می‌برد و به همین دلیل است که نیروی اضافی برای کمک به فرآیند ته نشینی اعمال می‌شود.
در این دستگاه، نمونه حول یک محور می‌چرخد و در نتیجه نیروی عمودی به نام نیروی گریز از مرکز ایجاد می‌شود که بر ذرات مختلف روی نمونه اثر می‌گذارد.
مولکول‌های بزرگ‌تر سریع‌تر حرکت می‌کنند، در حالیکه مولکول‌های کوچک‌تر کندتر حرکت می‌کنند.
در همان زمان، مولکول‌های متراکم‌تر به سمت بیرون به سمت حاشیه لوله‌ها حرکت کرده، در حالیکه مولکول‌های با چگالی کمتر به سمت مرکز لوله می‌چرخند.
پس از تکمیل فرآیند، ذرات بزرگ‌تر و متراکم‌تر ته نشین شده و رسوب‌هایی را در پایین لوله تشکیل می‌دهند. ذرات کوچک‌تر و کم چگال‌تر یا در مایع رویی معلق باقی می‌مانند یا روی سطح شناور می‌شوند.

شکل: انواع مختلف این دستگاه. منابع تصویر: Beckman Coulter، NuAire و Thermo Fisher Scientific.

انواع

بر اساس کاربرد و هدف، اولتراسانتریفیوژ دو نوع است.

اولتراسانتریفیوژ تحلیلی (AUC)

همانطور که از نام آن پیداست سانتریفیوژهای تحلیلی، اولتراسانتریفیوژهایی هستند که برای تجزیه و تحلیل ذرات مختلف موجود در نمونه استفاده می‌شوند.
اولتراسانتریفیوژ تحلیلی (AUC) یک روش همه کاره و قوی برای تجزیه و تحلیل کمی ماکرومولکول‌ها در محلول است.
این دستگاه ها دارای سیستم‌های تشخیص برای نظارت بر چرخش و موقعیت ذرات در زمان واقعی برای تعیین ضریب رسوب است که به تجزیه و تحلیل ذرات بر اساس شکل، اندازه و جرم کمک می‌کند.
اولتراسانتریفیوژ تحلیلی برای تعیین جرم مولکولی نسبی یک ماکرومولکول را می‌توان با رویکرد سرعت ته نشینی یا روش تعادل ته نشینی انجام داد.
خواص هیدرودینامیکی ماکرومولکول‌ها با ضرایب ته نشینی آن‌ها توصیف می‌شود. ضرایب را می‌توان از روی سرعت حرکت مولکول‌های زیستی خاص در میدان گرانشی تعیین کرد.
ضریب رسوب را می‌توان برای مشخص کردن تغییرات در اندازه و شکل ماکرومولکول‌ها با تغییر شرایط تجربی استفاده کرد.
سه سیستم نوری برای اولتراسانتریفیوژ تحلیلی (جذب، تداخل و فلورسانس) موجود است که امکان مشاهده دقیق و انتخابی رسوب‌گذاری را در زمان واقعی فراهم می‌کند.
یکی از نمونه‌های سیستم‌های تشخیص مورد استفاده در اولتراسانتریفیوژ، سیستم نوری Schlieren است که ذرات موجود در سانتریفیوژ را در زمان واقعی مشاهده می‌کند تا موقعیت و حرکت آن‌ها را تعیین کند.
بر اساس موقعیت، ضرایب رسوب را می‌توان تعیین کرد، که امکان تعیین خواص مولکول‌های مختلف را فراهم می‌کند.
اولتراسانتریفیوژ تحلیلی بیشتر برای تعیین خواص بیومولکول‌ها مانند پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شود.

اولتراسانتریفیوژ آماده سازی

اولتراسانتریفیوژهای آماده سازی سانتریفیوژهایی هستند که عمدتاً برای جداسازی ذرات در یک نمونه با فرآیند سانتریفیوژ استفاده می‌شوند.
در یک اجرای مقدماتی اولتراسانتریفیوژ، محتویات لوله‌ها پس از دوره سانتریفیوژ تجزیه و تحلیل می‌شود، برخلاف سانتریفیوژ تحلیلی که در آن تجزیه و تحلیل در طول فرآیند سانتریفیوژ انجام می‌شد.
اولتراسانتریفیوژهای آماده سازی را می‌توان برای انواع مختلفی از فرآیندهای سانتریفیوژ مانند سانتریفیوژ با گرادیان چگالی، سانتریفیوژ دیفرانسیل و سانتریفیوژ ایزوپیکنیک استفاده کرد.
ذرات در یک نمونه یا بر اساس چگالی یا اندازه آن‌ها از هم جدا می‌شوند.
در سانتریفیوژ با گرادیان چگالی و سانتریفیوژ ایزوپیکنیک، ذرات نمونه بر اساس چگالی آن‌ها جدا می‌شوند. ذرات مختلف موجود در یک نمونه به شکل نوارهایی در سطوح مجزا جدا می‌شوند که چگالی ذره با چگالی محیط برابر است.
اما در سانتریفیوژ دیفرانسیل، ذرات با اعمال سرعت‌های مختلف روتورها جدا می‌شوند. ذرات بزرگ‌تر در سرعت‌های پایین‌تر ته نشین می‌شوند درحالیکه ذرات کوچک‌تر به سرعت بالاتری برای جداسازی نیاز دارند.
از آنجاییکه ذرات بر اساس چگالی و اندازه جدا می‌شوند، می‌توان از اولتراسانتریفیوژهای آماده سازی برای تعیین چگالی و اندازه ذرات مختلف استفاده کرد.

قطعات اولتراسانتریفیوژ

اولتراسانتریفیوژها با قطعات و اجزای مختلفی ارائه می‌شوند که عملکردهای مختلفی را انجام می‌دهند.
روتورها جزء ضروری هر اولتراسانتریفیوژ هستند. اولتراسانتریفیوژها از هر سه نوع روتور، یعنی روتورهای عمودی، روتورهای نوسانی و روتورهای با زاویه ثابت استفاده می‌کنند.
روتور نوسانی رایج‌ترین روتور مورد استفاده در اولتراسانتریفیوژ است زیرا بالاترین غلظت ذرات را ایجاد می‌کند. این به این دلیل است که جهت نیروی گریز از مرکز در روتورهای عمودی با موقعیت لوله‌ها همسو می‌شود.
درایو واحد قدرتی است که سلول‌ها یا لوله‌های نگهدارنده روتور را می‌چرخاند که حاوی محلول مولکول‌ها یا سوسپانسیون ذرات است.
علاوه بر درایو الکتریکی قابل تعویض و روتورها، شامل روتورهای تحلیلی با حداکثر چهار سلول، دستگاه‌های دما با برد و کنترل از 0 تا 40 درجه، سلول‌هایی با ضخامت‌هایی که ضریب حساسیت 10 را پوشش می‌دهند، و پنجره‌های کوارتز که چندین سلول را دربرمی‌گیرند، به طور همزمان استفاده شود.
سیستم دما امکان کنترل دما را در سیستم فراهم می‌کند زیرا تولید گرما در طول عملیات اولتراسانتریفیوژ در سرعت‌های بالا رایج است.
اولتراسانتریفیوژ تحلیلی همچنین دارای یک مقایسه کننده دو بعدی با ماشین حساب و سیستم‌های جذب نوری است. سیستم‌های نوری برای تجزیه و تحلیل بلادرنگ مولکول‌ها ضروری هستند.
علاوه بر این، ممکن است یک دستگاه ایجاد گرادیان، رفرکتومترهای دستی و یک اسپکتروفتومتر ضبط کننده با سلول جریان و کلکتور کسری نیز در یک اولتراسانتریفیوژ آماده سازی وجود داشته باشد.

روش/ مراحل کار

فرآیند کار یک اولتراسانتریفیوژ ممکن است بسته به اینکه تحلیلی باشد یا آماده سازی متفاوت باشد. به طور کلی، مراحل زیر در هنگام انجام اولتراسانتریفیوژ تحلیلی انجام می‌شود:

اندازه‌های کوچک نمونه (20-120 میلی‌متر مکعب) در سلول‌ها گرفته می‌شود تا در داخل اولتراسانتریفیوژ قرار گیرند.
سپس این دستگاه به گونه‌ای عمل می‌کند که نیروی گریز از مرکز باعث مهاجرت تصادفی مولکول‌های زیستی توزیع شده از طریق حلال به صورت شعاعی به سمت خارج از مرکز چرخش می‌شود.
فاصله مولکول‌ها از مرکز از طریق سیستم نوری Schlieren تعیین می‌شود.
نموداری از غلظت املاح در مقابل مجذور فاصله شعاعی از مرکز چرخش رسم می‌شود که بر اساس آن جرم مولکولی تعیین می‌شود.

روش زیر برای عملکرد اولتراسانتریفیوژ آماده سازی است:

سانتریفیوژ گرادیان چگالی

در اولتراسانتریفیوژ آماده سازی با استفاده از گرادیان چگالی، باید یک گرادیان چگالی تهیه شود. برای این کار، یک لایه ساکارز با غلظت کمتر روی یک لایه ساکارز غلیظ‌تر اعمال می‌شود که یک گرادیان چگالی ساکارز ایجاد می‌کند. برخی از اولتراسانتریفیوژها دارای دستگاه‌های شیب‌ساز هستند که می‌توانند به تنهایی گرادیان را بسازند.
سپس نمونه در لوله سانتریفیوژ بر روی گرادیان قرار می‌گیرد و سپس لوله‌ها در قفسه‌های روتورهای اولتراسانتریفیوژ قرار می‌گیرند.
قبل از شروع فرآیند، دما و زمان در اولتراسانتریفیوژ تنظیم می‌شود.
درب بسته شده و فرآیند شروع می شود.
ذرات از طریق گرادیان حرکت می‌کنند تا زمانی که به نقطه‌ای برسند که در آن چگالی آن‌ها با چگالی محیط اطراف مطابقت داشته باشد.
ذرات به عنوان واحدهای جدا شده به دست می‌آیند.

سانتریفیوژ دیفرانسیل

در سانتریفیوژ افتراقی یا دیفرانسیل، نمونه در محیط حاوی بافر همگن می‌شود.
سپس نمونه در لوله سانتریفیوژ قرار می‌گیرد که در یک نیروی گریز از مرکز خاص برای مدت زمان مشخصی در یک دمای خاص عمل می‌کند.
در پایان این عمل رسوبی در پایین لوله تشکیل شده که از مایع رویی جدا می‌شود.
مایع رویی به یک لوله سانتریفیوژ جدید اضافه شده و در آنجا با سرعت دیگری برای زمان و دمای خاص سانتریفیوژ می‌شود.
مجدداً مایع رویی از رسوب تشکیل شده جدا می‌شود.
این مراحل تا زمانی ادامه می‌یابد که همه ذرات از یکدیگر جدا شوند.
سپس ذرات را می‌توان با آزمایش شاخص‌هایی که مختص ذرات خاص هستند شناسایی کرد.

موارد استفاده

اولتراسانتریفیوژهای آماده سازی در زیست شناسی برای پلت کردن (ته‌نشین کردن) قسمتی از اندامک‌های سلولی مانند میتوکندری، ریبوزوم‌ها و حتی ویروس‌ها استفاده می‌شود.
سانتریفیوژ گرادیان چگالی از گرادیان نمک سزیم برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک مانند DNA و RNA استفاده می‌کند.
اولتراسانتریفیوژ تحلیلی امکان تشخیص و شناسایی تغییرات ساختاری ماکرومولکولی را به دلیل تغییر در pH، دما و سایر عوامل محیطی فراهم می‌کند.
AUC همچنین امکان تعیین استوکیومتری ماکرومولکول‌های مختلف مانند جرم مولکولی، اندازه و غیره را فراهم می‌کند.
اولتراسانتریفیوژهای تحلیلی همچنین به تمایز بین مونتاژ و جداسازی مجتمع‌های بیومولکولی مختلف کمک می‌کنند.
این دستگاه ها همچنین در تعیین چگالی ماکرومولکول‌های مختلف استفاده می‌شوند.
علاوه بر این، امکان تصفیه عصاره‌های مختلف بیولوژیکی خام را نیز فراهم می‌کند.

موارد احتیاط

اولتراسانتریفیوژها دستگاه‌های حساسی هستند، به همین دلیل است که باید با رعایت اقدامات احتیاطی کامل، از آن‌ها استفاده کرد. برخی از این اقدامات احتیاطی عبارتند از:

در حین کار کردن اولتراسانتریفیوژ، دستورالعمل سازنده باید همیشه رعایت شود.
روتورها باید با دقت کار شوند و باید به طور معمول از نظر علائم خوردگی و ترک چک شوند.
در حین افزودن لوله‌ها به روتورها، حجم نمونه در لوله‌ها باید برابر باشد.
تعداد لوله‌های اضافه شده به اولتراسانتریفیوژ باید همیشه متعادل باشد. اگر بار نمونه کافی در دسترس نباشد، آب مقطر باید برای تنظیم به لوله‌ها اضافه شود.
سرعت روتور نباید از مقدار تعیین شده تجاوز کند.
درب محفظه باید همیشه در حین کار بسته بماند.
برای جلوگیری از آسیب در روتورها، باید از راهنمای سازنده مراقبت و مدیریت روتور پیروی کرد.

همچنین مطالب بیشتری در رابطه با دستگاه های آزمایشگاهی بخوانید: