مقدمه‌ای بر الایزا ساندویچ (Sandwich ELISA)
الایزا ساندویچ آنتی ژن‌ها را بین دو لایه آنتی بادی شناسایی می‌کند (فرآیند ضبط و تشخیص). الایزا ساندویچ به این دلیل نامگذاری شده است که آنتی ژن بین دو آنتی بادی قرار می‌گیرد. در آزمایش ساندویچ از دو آنتی بادی مختلف استفاده می‌شود که با اپی توپ‌های مختلف روی آنتی ژن با غلظتی که نیاز به تعیین دارد واکنش نشان می‌دهند.
آنتی ژنی که باید اندازه گیری شود باید حاوی حداقل دو اپی توپ آنتی ژنی باشد که قابلیت اتصال به آنتی بادی را داشته باشد، زیرا حداقل دو آنتی بادی در روش ساندویچ عمل می‌کنند. آنتی بادی‌های مونوکلونال یا پلی کلونال را می‌توان به عنوان آنتی بادی‌های ضبط و تشخیص در سیستم‌های Sandwich ELISA استفاده کرد.
آنتی بادی‌های مونوکلونال یک اپی توپ را تشخیص می‌دهند که امکان تشخیص دقیق و کمی تفاوت‌های کوچک در آنتی ژن را فراهم می‌کند. پلی کلونال اغلب به عنوان آنتی بادی جذب برای پایین آوردن هر چه بیشتر آنتی ژن استفاده می‌شود.
مقدار ثابتی از یک آنتی بادی به یک سری از تکیه گاه‌های جامد، مانند صفحه چند چاهکی میکروتیتر پلاستیکی متصل می‌شود. محلول‌های آزمایشی حاوی آنتی ژن با غلظت نامشخص به چاهک‌ها اضافه شده و اجازه داده می‌شود تا باند شوند. آنتی ژن غیر متصل با شستشو حذف می‌شود و آنتی بادی دوم که به یک آنزیم متصل است اجازه اتصال پیدا می‌کند.
این مجموعه آنتی بادی-آنزیم دوم، سیستم نشانگر آزمایش را تشکیل می‌دهد. آنتی ژن به عنوان پل عمل می‌کند، بنابراین هر چه آنتی ژن در محلول آزمایش بیشتر باشد، آنتی بادی مرتبط با آنزیم بیشتری متصل می‌شود. محلول آزمایش به موازات مجموعه‌ای از محلول‌های استاندارد با غلظت‌های شناخته شده آنتی ژن استفاده می‌شود که به عنوان کنترل و مرجع عمل می‌کنند. نتایج به‌دست‌آمده از محلول‌های استاندارد برای ساخت منحنی اتصال آنتی‌بادی دوم به عنوان تابعی از غلظت آنتی‌ژن استفاده می‌شود. غلظت آنتی ژن‌ها را می توان از جذب محلول‌های استاندارد استنباط کرد.
الایزا ساندویچ
الایزا ساندویچ برای شناسایی آنتی ژن استفاده می‌شود. در این آزمایش، آنتی بادی شناخته شده پوشش داده شده و بر روی چاهک‌های صفحات میکروتیتر بی حرکت می‌شود. نمونه آزمایشی حاوی آنتی ژن مشکوک به چاهک‌ها اضافه می‌شود و اجازه داده می‌شود تا با آنتی بادی‌های موجود در چاهک‌ها واکنش دهد. پس از مرحله شستشوی چاه، دومین آنتی بادی کونژوگه با آنزیم مخصوص اپی توپ متفاوت آنتی ژن اضافه شده و اجازه داده می‌شود تا انکوبه شود.
پس از حذف هر گونه آنتی بادی ثانویه آزاد با شستشوی مجدد، بستر ویژه اضافه می‌شود و واکنش کروموژنیک بعدی اندازه گیری می‌شود. سپس واکنش کروموژنیک با یک منحنی استاندارد برای تعیین مقدار دقیق آنتی ژن موجود در نمونه آزمایش مقایسه می‌شود. در یک آزمایش مثبت، آنزیمی بر روی بستر برای تولید رنگ اثر می‌گذارد و شدت آن را می‌توان با اسپکتروفتومتر یا خوانش‌گر الایزا (ELISA Reader) اندازه‌گیری کرد. تغییر رنگ را می‌توان با چشم غیر مسلح نیز مشاهده کرد.
مراحل روش الایزا ساندویچ
مراحل روش الایزا ساندویچ به شرح زیر است:
- سطحی را آماده کنید که مقدار مشخصی از آنتی بادی جذب به آن متصل است.
- هر گونه محل اتصال غیر اختصاصی روی سطح را مسدود کنید.
- نمونه حاوی آنتی ژن را به صفحه اضافه کنید.
- صفحه را بشویید، به طوری که آنتی ژن غیر متصل حذف شود.
- یک آنتی بادی خاص اضافه می شود و به آنتی ژن متصل می شود از این رو آنتی‌ژن بین دو آنتی بادی گیر می‌کند.
- آنتی‌بادی‌های ثانویه مرتبط با آنزیم را به عنوان آنتی‌بادی‌های تشخیص اضافه کنید که به‌طور اختصاصی به ناحیه Fc آنتی‌بادی (غیر اختصاصی) متصل می‌شوند.
- صفحه را بشویید، به طوری که آنتی بادی-آنزیم متصل نشده حذف شوند.
- سوبسترا را اضافه کنید که توسط آنزیم به سیگنال رنگی یا فلورسنت یا الکتروشیمیایی تبدیل می‌شود.
- جذب یا فلورسانس یا سیگنال الکتروشیمیایی (به عنوان مثال، جریان) چاهک‌های صفحه را برای تعیین حضور و کمیت آنتی ژن اندازه گیری کنید.
مزایای الایزا ساندویچ
- از ویژگی بالایی برخوردار است زیرا از دو آنتی بادی استفاده می‌شود و آنتی ژن/آنالیت به طور خاص گرفته و شناسایی می‌شود.
- برای نمونه‌های پیچیده مناسب است زیرا آنتی ژن نیازی به خالص سازی قبل از اندازه گیری ندارد.
- دارای انعطاف و حساسیت خوبی است، زیرا می‌توان از هر دو روش تشخیص مستقیم و غیر مستقیم استفاده کرد.
همچنین بخوانید:
- کارگاه الایزا
- الایزای غیر مستقیم (Indirect ELISA): معرفی، مراحل، مزایا و پروتکل
- تکنیک الایزا و انواع آن
مترجم: امید آهنگریان ابهری
