اصول کلونینگ و کاربرد آن در اهداف درمانی

مروری بر کلونینگ مولکولی

کلونینگ مولکولی به ما امکان می‌دهد ژن‌ها را مطالعه کنیم، ژن‌ها را اصلاح کنیم، ژن‌های اصلاح‌شده را دوباره به میزبان طبیعی یا میزبان دیگری وارد کنیم، یا یک پروتئین نوترکیب را بیش از حد بیان کنیم.

شما می توانید کلونینگ مولکولی را با ترکیب یک قطعه DNA در یک ناقل، مانند یک پلاسمید (یک DNA نوترکیب) انجام دهید تا DNA نوترکیب یکسان بیشتری در یک میزبان زنده بسازید.

مواردی که باید قبل از کلونینگ در نظر بگیرید، در دسترس بودن مواد کلونینگ، هدف تحقیق و سطح دشواری پروتکل شما است.

مواد مورد نیاز برای کلونینگ

برای شروع، شما باید چند ماده مهم برای کلونینگ را آماده کنید:

قطعه DNA

منبع قطعه DNA یا DNA درج شده، می تواند DNA ژنومی، DNA مکمل، DNA پلاسمید، محصول PCR یا DNA مصنوعی باشد. قطعه DNA درج شده بایستی دارای توالی های خاصی در انتهای قطعات سازگار با وکتور آماده شده باشد. شما می توانید این توالی های خاص را با استفاده از PCR به داخل DNA خود اضافه کنید.

وکتور

وکتور یک مولکول DNA است که می تواند قطعه DNA درج شده برای تولید DNA نوترکیب و تکثیر در یک میزبان خاص را حمل کند.

چند نمونه از وکتورها عبارتند از:

Cosmid: یک ناقل DNA بزرگ حاوی توالی DNA فاژ  λ که می تواند قطعات بزرگ DNA تا 45 کیلو باز را به میزبان حمل کند.

کروموزوم های مصنوعی: یک ناقل DNA بزرگ که می تواند وظایف یک کروموزوم را انجام دهد.

پلاسمید: یک DNA حلقوی خارج کروموزومی کوچک که می تواند در یک سلول تکثیر شود و معمولا در کلونینگ استفاده می شود.

اجزای موجود در یک وکتور پلاسمید:

منشا همانند سازی (ORI)

منشا همانندسازی یا ORI یک توالی یا جز مورد نیاز روی پلاسمید می باشد که برای همانندسازی آن در داخل میزبان مورد نیاز است.

نشانگر انتخابی

عنصر مورد نیاز برای کلونینگ برای انتخاب میزبانی که حامل وکتور است. فقط آن دسته از سلول‌های میزبان که ناقل را در داخل خود دارند، در محیطی که فشار انتخاب را دارد رشد می‌کنند، که معمولا یک آنتی‌بیوتیک است. در حالی که سلول های میزبان که ناقل را ندارند، از بین می روند زیرا نمی توانند آنتی بیوتیک را تحمل کنند. به این ترتیب، آزمایش‌کننده قادر خواهد بود سلول‌های میزبان را که دارای وکتور هستند، نسبت به سلول‌هایی که ناقل ندارند، انتخاب کند.

جایگاه چندگانه کلونینگ یا multiple coloning site (MCS)

قسمتی بر روی قطعه پلاسمید که حاوی مکان های آنزیم محدود کننده است تا امکان درج DNA را فراهم کند.

ناحیه پروموتر

ناحیه ای که بیان پروتئین DNA کلون شده را هدایت می کند.

برچسب پروتئین یا protein tag

توالی خاصی که پروتئینی با عملکرد خاص تولید می کند و معمولا به پروتئین نوترکیب متصل می شود. نمونه ای از برچسب پروتئین لوسیفراز یا GFP است که برای نظارت یا تعیین کمیت پروتئین است.

سیگنال پلی آدنیلاسیون

جزئی حاوی poly-A که برای تولید پروتئین مهم است.

سلول های مستعد یا component cell

پس از اینکه یک قطعه DNA در ناقل پلاسمید ادغام شد، مرحله بعدی کلونینگ انجام مرحله انتقال است. در این مرحله انتقال، DNA  نوترکیب توسط یک فرآیند شیمیایی یا توسط الکتروپوراسیون به سلول مستعد وارد می شود. سلولهای مستعد سلولهایی هستند که به طور موقت به DNA خارج سلولی نفوذپذیر هستند. ارگانیسم های میزبان که معمولا در آزمایشگاه ها استفاده می شوند عبارتند از: اشریشیا کلی و ساکارومایسس سرویزیه.

محیط انتخابی

محیط انتخابی یک محیط رشد حاوی یک عامل انتخابی برای رشد میزبان است.

هنگامی که آنتی بیوتیک را برای کلونینگ انتخاب می‌کنید، محیط رشد شما باید حاوی آنتی بیوتیک باشد. آنتی بیوتیک‌ها باید با ژن نشانگر قابل انتخاب آنتی بیوتیک روی ناقل مطابقت داشته باشند.

رایج ترین آنتی بیوتیک‌های مورد استفاده برای انتخاب آمپی سیلین، کانامایسین و کلرامفنیکل هستند.

 

روش های کلونینگ

چندین روش مختلف برای کلونینگ وجود دارد و شما باید رویکرد مناسب را برای تحقیق خود پیدا کنید. در زیر چند نمونه از روش‌های کلونینگ محبوب برای تولید یک ساختار DNA نوترکیب آورده شده است:

 

شبیه سازی مبتنی بر آنزیم محدود کننده

آنزیم های محدود کننده آنزیم هایی هستند که DNA را در نزدیکی یک توالی نوکلئوتیدی کوتاه خاص به نام مکان محدود کننده برش می دهند. روش کلونینگ مبتنی بر آنزیم محدود کننده به فعالیت آنزیم‌های محدودکننده برای برش هر دو وکتور و درج DNA بستگی دارد و این روش همچنین به DNA لیگاز برای چسباندن قطعه DNA در ناقل بستگی دارد. این روش زمانی مفید است که یک درج DNA به پلاسمید اضافه شود.

با استفاده از PCR، می‌توانید محل‌های آنزیم محدودکننده را بر روی قطعه DNA خود اضافه کنید تا با این روش سازگاری داشته باشید.

شما می توانید از یک آنزیم محدود کننده یا دو آنزیم برای برش قطعه و ناقل DNA خود استفاده کنید. هنگام استفاده از دو آنزیم، هر دو آنزیم باید سازگار باشند یا در یک بافر آنزیم محدود کننده به خوبی کار کنند.

پلاسمید

پلاسمید یک قطعه کوچک و دایره‌ای از DNA است که با DNA کروموزومی متفاوت است که شامل تمام مواد ژنتیکی موجود در کروموزوم‌های موجودات زنده است و مستقل از DNA کروموزومی تکثیر می شود.

پلاسمیدها عمدتا در باکتری‌ها یافت می‌شوند، اما پلاسمیدها را می‌توان در ارگانیسم‌های باستانی و چند سلولی نیز یافت.

پلاسمیدها معمولا حداقل یک ژن را حمل می کنند و بسیاری از ژن هایی که پلاسمیدها حمل می کنند برای ارگانیسم های میزبان آنها مفید هستند. اگرچه آنها ژن های جداگانه ای از میزبان خود دارند، اما دارای زندگی مستقلی نمی باشند.

نقش های پلاسمیدها

پلاسمیدها عملکردهای مختلفی دارند. پلاسمیدها ممکن است حاوی ژن هایی باشند که بقای یک ارگانیسم را از طریق کشتن سایر ارگانیسم ها یا با دفاع از سلول میزبان با تولید سموم افزایش می دهند. برخی از پلاسمیدها فرآیند تکثیر را در باکتری ها تسهیل می کنند. از آنجایی که پلاسمیدها بسیار کوچک هستند، معمولا فقط حاوی چند ژن با عملکرد خاص هستند. پلاسمیدهای متعددی می توانند در یک سلول وجود داشته باشند که هر کدام عملکردهای متفاوتی دارند.

انواع کلی پلاسمیدها

Conjugative and Non-Conjugative

روش های زیادی برای طبقه بندی پلاسمیدها از عمومی به اختصاصی وجود دارد. یکی از راه ها این است که آنها را به صورت Conjugative and Non-Conjugative گروه بندی کنید.

باکتری ها از طریق پیوند جنسی، یعنی انتقال ماده ژنتیکی از یک سلول باکتری به سلول دیگر، یا از طریق تماس مستقیم یا پل بین دو سلول، تکثیر می شوند. برخی از پلاسمیدها حاوی ژن هایی به نام ژن های انتقال هستند که شروع کونژوگه را تسهیل می کنند. پلاسمیدهای Non-Conjugative نمی توانند فرآیند کونژوگه را شروع کنند و فقط از طریق کونژوگه جنسی با کمک پلاسمیدهای Conjugative منتقل می شوند.

ناسازگاری

پلاسمیدها را می توان از طریق ناسازگاری یا incompatibility نیز طبقه بندی کرد. در یک باکتری، پلاسمیدهای مختلف تنها در صورتی می توانند همزمان ایجاد شوند که با یکدیگر سازگار باشند. یک پلاسمید ناسازگار از سلول باکتری خارج می شود.

انواع خاصی از پلاسمیدها

پنج نوع اصلی پلاسمید وجود دارد: پلاسمیدهای F باروری، پلاسمیدهای مقاومتی، پلاسمیدهای virulence، پلاسمیدهای تخریب کننده و پلاسمیدهای  Col.

پلاسمیدهای F باروری

پلاسمیدهای باروری که به عنوان پلاسمیدهای F نیز شناخته می شوند، حاوی ژن های انتقالی هستند که به ژن ها اجازه می دهند از طریق کونژوگه از یک باکتری به باکتری دیگر منتقل شوند. اینها دسته وسیعی از پلاسمیدهای مزدوج را تشکیل می دهند. پلاسمیدهای F اپیزوم هایی هستند که پلاسمیدهایی هستند که می توانند به DNA کروموزومی وارد شوند.

باکتری هایی که دارای پلاسمید F هستند به عنوان F مثبت (F+) شناخته می شوند و باکتری های بدون آن F منفی(F-) هستند. هنگامی که یک باکتری F+ با یک باکتری F- کونژوگه می شود، دو باکتری F+ ایجاد می شود. در هر باکتری فقط یک پلاسمید F وجود دارد.

پلاسمیدهای مقاومتی

پلاسمیدهای مقاومتی یا R حاوی ژن هایی هستند که به سلول باکتری کمک می کنند در برابر عوامل محیطی مانند سموم یا آنتی بیوتیک ها دفاع کنند. برخی از پلاسمیدهای مقاومتی می توانند خود را از طریق کونژوگه انتقال دهند. هنگامی که این اتفاق می افتد، یک سویه از باکتری ها می توانند به آنتی بیوتیک ها مقاوم شوند.

پلاسمیدهای virulence

هنگامی که یک پلاسمید virulence درون یک باکتری قرار می گیرد، آن باکتری را به یک عامل بیماری زا تبدیل می کند که عامل بیماری است. باکتری هایی که باعث بیماری می شوند می توانند به راحتی در بین افراد مبتلا پخش و تکثیر شوند. باکتری اشریشیا کلی (E. coli) دارای چندین پلاسمید virulence است.

E.coli به طور طبیعی در روده انسان و در حیوانات دیگر یافت می شود، اما گونه های خاصی از E. coli می توانند باعث اسهال و استفراغ شدید شوند. سالمونلا انتریکا باکتری دیگری است که حاوی پلاسمیدهای virulence است.

پلاسمیدهای تخریب کننده

پلاسمیدهای تخریب کننده به باکتری میزبان کمک می کنند تا ترکیباتی را که معمولا در طبیعت یافت نمی شوند مانند کافور، زایلن، تولوئن و اسید سالیسیلیک هضم کند. این پلاسمیدها حاوی ژن هایی برای آنزیم های خاصی هستند که ترکیبات خاصی را تجزیه می کنند. پلاسمیدهای تخریب کننده مزدوج هستند.

پلاسمیدهای Col

پلاسمیدهای Col حاوی ژن‌هایی هستند که باکتریوسین‌ها را می‌سازند (همچنین به عنوان کولیسین شناخته می‌شوند)، که پروتئین‌هایی هستند که باکتری‌های دیگر را می‌کشند و در نتیجه از باکتری میزبان دفاع می‌کنند. باکتریوسین ها در بسیاری از انواع باکتری ها از جمله E. coli یافت می شوند که آنها را از پلاسمید ColE1 می گیرد.

کاربردهای پلاسمیدها

انسان‌ها کاربردهای زیادی برای پلاسمیدها ایجاد کرده اند و نرم افزاری برای ثبت توالی DNA پلاسمیدها برای استفاده در بسیاری از تکنیک های مختلف ایجاد کرده اند. پلاسمیدها در مهندسی ژنتیک برای تقویت یا تولید نسخه‌های زیادی از ژن‌های خاص استفاده می‌شوند. در شبیه سازی مولکولی، پلاسمید نوعی ناقل است.

وکتور یک توالی DNA است که می تواند مواد ژنتیکی خارجی را از یک سلول به سلول دیگر منتقل کند، جایی که ژن ها می توانند بیشتر بیان و تکثیر شوند. پلاسمیدها در کلونینگ بخش های کوتاه DNA مفید هستند. همچنین، از پلاسمیدها می توان برای تکثیر پروتئین ها، مانند پروتئینی که انسولین را کد می کند، در مقادیر زیاد استفاده کرد.

علاوه بر این، پلاسمیدها به عنوان راهی برای انتقال ژن ها به سلول های انسانی به عنوان بخشی از ژن درمانی در حال بررسی هستند. اگر بیمار دارای یک اختلال ارثی شامل جهش ژنی باشد، سلول ها ممکن است فاقد پروتئین خاصی باشند. قرار دادن یک پلاسمید در DNA به سلول ها اجازه می دهد پروتئینی را که فاقد آن هستند بیان کنند.

آنزیم های محدودکننده

اصطلاح آنزیم محدود کننده از مطالعات انتروباکتریا فاژ λ (لامبدا فاژ) در آزمایشگاه‌های ورنر آربر و متیو مزلسون نشات گرفته است. توانایی برخی از سویه های E. coli برای مهار فعالیت فاژ لامبدا توسط برش آنزیمی DNA فاژ مورد مطالعه قرار گرفت و آنزیم مسئول این محدودیت رشد را آنزیم محدود کننده نامیدند.

ورنر آربر، دنیل ناتانز و همیلتون او. اسمیت در سال 1978 جایزه نوبل فیزیولوژی یا پزشکی را برای کشف و شناسایی آنزیم‌های محدودکننده که منجر به توسعه فناوری DNA نوترکیب شد، دریافت کردند.

آنزیم‌های محدودکننده را قیچی مولکولی نیز می‌نامند، زیرا آن‌ها DNA را در نزدیک توالی‌های شناسایی خاص که به عنوان مکان‌های محدود شناخته می‌شوند، می‌شکنند. این آنزیم ها روی هر یک از دو رشته DNA یک برش ایجاد می کنند و به آنها اندونوکلئازهای محدود کننده نیز می گویند.

ویروس‌ها سلول‌های میزبان را با تزریق DNA خود به سلول ها آلوده می کنند. این DNA ویروسی دستگاه سلول میزبان را برای تولید مثل نتاج ویروسی ربوده و منجر به مرگ سلول میزبان می شود. یک مکانیسم حفاظتی اصلی شامل استفاده از آنزیم‌های محدودکننده برای تخریب DNA ویروسی مهاجم با جدا کردن آن در مکان‌های محدودکننده خاص است.

در عین حال، سلول میزبان با استفاده از آنزیم‌های دیگری به نام متیلازها، که بازهای آدنین یا سیتوزین را در توالی‌های تشخیص میزبان متیله می‌کنند، از جدا شدن DNA خود محافظت می‌کند. برای هر یک از آنزیم های محدود کننده، سلول میزبان متیلاز مربوطه را تولید می کند که متیله می شود و DNA  میزبان را از تخریب محافظت می کند.

نامگذاری

اسمیت و ناتانز در سال 1973 دستورالعمل های نامگذاری را برای اندونوکلئازهای محدودکننده پیشنهاد کردند. طبق این دستورالعمل ها، نام آنزیم ها با مخفف سه حرفی ایتالیک شروع می شود.

حرف اول نشان دهنده اولین حرف از جنس باکتری است که آنزیم از آن جدا شده است و دو حرف بعدی از گونه باکتری گرفته شده است. این ممکن است با حروف یا اعداد اضافی برای نشان دادن سروتیپ یا سویه دنبال شود. پس از آن یک فاصله و یک عدد رومی برای نشان دادن زمان شناسایی وجود دارد. به عنوان مثال، Hind III  سومین آنزیم از چهار آنزیم جدا شده از سروتیپ d.6 هموفیلوس آنفولانزا بود.

اندونوکلئازهای محدود کننده

آنزیم محدود کننده چیست؟

آنزیم های محدود کننده به طور کلی بر اساس ترکیب زیر واحد، موقعیت برش، ویژگی توالی و الزامات کوفاکتور به چهار نوع طبقه بندی می شوند. با این حال، توالی‌یابی اسیدهای آمینه تنوع فوق‌العاده‌ای را در میان آنزیم‌های محدودکننده کشف کرده است و نشان می‌دهد که در سطح مولکولی، بیش از چهار نوع مختلف وجود دارد.

آنزیم های نوع I

آنزیم‌های نوع I آنزیم‌های پیچیده، چند زیر واحدی و ترکیبی محدودکننده و اصلاح‌کننده هستند که DNA را به‌طور تصادفی و دور از توالی‌های تشخیصشان برش می‌دهند. در ابتدا تصور می شد که آنزیم های نوع I نادر هستند، اما اکنون از تجزیه و تحلیل ژنوم های توالی شده می دانیم که آنها رایج هستند. آنزیم‌های نوع I از اهمیت بیوشیمیایی قابل‌توجهی برخوردارند، اما ارزش عملی کمی دارند زیرا قطعات محدودکننده گسسته یا الگوهای باند ژل مجزا تولید نمی‌کنند.

آنزیم های نوع دوم

آنزیم‌های نوع II، DNA را در موقعیت‌های تعریف شده نزدیک یا درون توالی‌های تشخیص خود برش می‌دهند. آنها قطعات محدود کننده گسسته و الگوهای باند ژل متمایز تولید می کنند و کلاس غالب مورد استفاده در آزمایشگاه برای تجزیه و تحلیل معمول DNA و کلونینگ ژن هستند.

آنزیم های نوع II به جای تشکیل یک خانواده واحد از پروتئین های مرتبط، مجموعه ای از پروتئین های نامرتبط از انواع مختلف هستند. آنزیم‌های نوع II اغلب از نظر توالی اسید آمینه با یکدیگر و در واقع با هر پروتئین شناخته‌شده دیگری کاملا متفاوت هستند، که نمونه‌ای از کلاس پروتئین‌هایی هستند که به سرعت در حال تکامل هستند که اغلب نشان‌دهنده دخالت در تعاملات میزبان-انگل هستند.

آنزیم های نوع III

آنزیم های نوع III نیز آنزیم های محدود کننده بزرگی هستند. آن‌ها خارج از توالی‌های تشخیص خود می‌شکافند و برای انجام برش به دو توالی در جهت‌های مخالف در یک مولکول DNA نیاز دارند. آنها به ندرت هضم کامل می دهند.

آنزیم های نوع IV

آنزیم‌های نوع IV، DNA اصلاح‌شده و معمولا متیله‌شده را تشخیص می‌دهند.

مطالب مرتبط:

 

 

REFERENCES

Amarakoon, I. I., Hamilton, C. L., Mitchell, S. A., Tennant, P. F., & Roye, M. E. (2017). Chapter 28 – Biotechnology. In S. Badal & R. Delgoda (Eds.), Pharmacognosy (pp. 549-563). Boston: Academic Press.

Bertero, A., Brown, S., & Vallier, L. (2017). Chapter 2 – Methods of Cloning. In M. Jalali, F. Y. L. Saldanha, & M. Jalali (Eds.), Basic Science Methods for Clinical Researchers (pp. 19-39). Boston: Academic Press.

Carter, M., & Shieh, J. C. (2010). Chapter 9 – Molecular Cloning and Recombinant DNA Technology. In M. Carter & J. C. Shieh (Eds.), Guide to Research Techniques in Neuroscience (pp. 207-227). New York: Academic Press.

Celie, P. H. N., Parret, A. H. A., & Perrakis, A. (2016). Recombinant cloning strategies for protein expression. Current Opinion in Structural Biology, 38, 145-154. doi: 10.1016/j.sbi.2016.06.010.

Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R.-Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., & Smith, H. O. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. doi:10.1038/nmeth.1318.

Griffiths A.J.F., Miller J.H., & Suzuki D.T., e. a. (2000). Cloning a specific gene. New York: W. H. Freeman and Company.

Lessard, J. C. (2013). Molecular cloning. Methods Enzymol, 529, 85-98. doi:10.1016/b978-0-12-418687-3.00007-0

Li, M. Z., & Elledge, S. J. (2012). SLIC: A Method for Sequence- and Ligation-Independent Cloning. In J. Peccoud (Ed.), Gene Synthesis: Methods and Protocols (pp. 51-59). Totowa, NJ: Humana Press.

Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., & al., e. (2000). DNA Cloning with Plasmid Vectors. New York: W. H. Freeman.

Park, J., Throop, A. L., & LaBaer, J. (2015). Site-Specific Recombinational Cloning Using Gateway and In-Fusion Cloning Schemes. Current protocols in molecular biology, 110(1), 3.20.21-23.20.23. doi:10.1002/0471142727.mb0320s110.

National Research Council Committee (1987). In Agricultural Biotechnology: Strategies for National Competitiveness. Washington (DC): National Academies Press (US) Copyright (c) National Academy of Sciences.

Trower, M. K., & Elgar, G. S. (1994). PCR cloning using T-vectors. Methods Mol Biol, 31, 19-33. doi:10.1385/0-89603-258-2:19.

Arber W, Linn S. 1969. DNA Modification and Restriction. Annu. Rev. Biochem.. 38(1):467-500. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.38.070169.002343

MESELSON M, YUAN R. 1968. DNA Restriction Enzyme from E. coli. Nature. 217(5134):1110-1114. https://doi.org/10.1038/2171110a0

Dussoix D, Arber W. 1962. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 5(1):37-49. https://doi.org/10.1016/s0022-2836(62)80059-x

Roberts RJ, Murray K. 1976. Restriction Endonuclease. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 4(2):123-164. https://doi.org/10.3109/10409237609105456

Kessler C, Manta V. 1990. Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases ? a review (edition 3). Gene. 92(1-2):1-240. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90486-b