آنالیزهای in-silico

سیستم CRISPR/Cas در چند سال اخیر به عنوان یک ابزار ویرایش ژنی، انقلابی با کاربرد گسترده برای بررسی عملکرد ژن در مرکز توجه قرار گرفته است با این حال، گردش سیستم CRISPR/Cas به تجزیه و تحلیل پیچیده دارد، بنابراین تبدیل به یکی از موانع برای محبوبیت بیشتر برنامه های کاربردی عملی می شود. اخیرا ظهور و پیشرفت روزافزون روش‌های in silico نقش مهمی در پشتیبانی و تقویت کار تجربی ایفا می‌کند.

پرده اسرارآمیز ژنوم و رونوشت در موجودات مختلف به دلیل تلاش‌های توالی‌یابی آشکار شده است. با این حال، عملکرد بیشتر ژن ها ناشناخته باقی می ماند. سخت ترین چالش مرتبط کردن تغییرات فنوتیپ به تغییرات در لایه های ژنتیکی بوده است. سیستم پیشرفته CRISPR/Cas برای دستکاری ژنتیکی ابزاری نوظهور برای حل این معزل است.

سیستم CRISPR/Cas از یک مکانیسم دفاعی ایمنی تطبیقی ​​پروکاریوتی در برابر اسیدهای نوکلئیک اگزوژن موجود در آرکی ها و باکتری‌ها ایجاد شده است، که از یک قانون جفت باز بین RNA هدف و راهنما (gRNA) پیروی می کند. نقش gRNA هدایت آنزیم Cas به موقعیت‌های سفارشی در حضور یک موتیف به نام PAM یا توالی جانبی PFS است. PAM/PFS یک جز قابل تشخیص است که به دنبال مکان‌های هدف قرار می‌گیرد و شکاف دقیق اسیدهای نوکلئیک اگزوژن مکمل gRNA را ممکن می‌سازد.

در انواع مختلف سیستم‌های CRISPR/Cas، gRNA می تواند CRISPR RNA (crRNA) باشد که یک نوع RNA کوتاه غیر کدکننده مشتق شده از آرایه های CRISPR می باشد. علاوه بر این، سیستم‌های CRISPR/Cas را براساس انواع مختلف ماژول های Cas و موقعیت آرایه CRISPR می توان به دو دسته، شش نوع و 30 زیرگروه تقسیم بندی کرد.

تا کنون، سیستم CRISPR/Cas به طور گسترده در مطالعات بنیادی و همچنین اقدامات بالینی در بین بیماری‌های متعدد استفاده شده است. نکته قابل توجه این است که کشف و اجرای سیستم CRISPR/Cas نیازمند یک گردش کار پیچیده است که از جمله آن می توان به شناسایی و انتخاب سیستم CRISPR/Cas، طراحی gRNA، ترانسفکسن، ایجاد کلون تک سلولی، غربالگری کلون و تجزیه و تحلیل سیستماتیک جهش اشاره نمود. برای هر کدام از مراحل ذکر شده بایستی زمان، پول و نیروی انسانی قابل توجهی را صرف نمود. خوشبختانه، پیشرفت در علوم کامپیوتر زمینه را برای رفع کمبود و تقویت روند کلی ایجاد نموده است.

روش های in silico مبتنی بر الگوریتم‌ها و چارچوب‌های مختلف، مزایای متفاوتی دارند و برای کاربردهای متنوع مناسب هستند. با وجود اینکه انواع ابزارهای in silico در سال‌های اخیر رشد قابل توجهی داشته اند، یک خلاصه جامع برای نقش آنها در فرآیند کلی از شناسایی سیستم تا کاربرد وجود ندارد، به طوری که بسیاری از محققان زیست‌شناسی احتمالا در انتخاب ابزارهای in silico سردرگم می شوند. بنابذاین بررسی صریح ابزارهای موجود ضروری می باشد.

در این مطلب ، هدف ما خلاصه کردن روش‌های منتشر شده in silico از سه جنبه اصلی (شناسایی سیستم CRISPR/Cas، طراحی gRNA و ارزیابی های پس از آزمون) می باشد. مسلما توضیح کاربرد این موارد برای اهداف مختلف و ارائه فرضیات ممکن منجر به بهبود های بیشتر در این زمینه خواهد شد.

شناسایی سیستم CRISPR/Cas

در مرحله سازگاری، باکتری ها یک قطعه DNA با نام protospacer را از فاژها یا پلاسمیدهای مهاجم کپی می کنند و آن را در ابتدای آرایه CRISPR در پایین دست توالی رهبر به عنوان یک فاصله دهنده جدید (spacer) می چسبانند. در مرحله بعد، آرایه های CRISPR رونویسی شده و به crRNA هایی پردازش می شوند که اطلاعات ژنتیکی جزئی از DNA مهاجم را دارند و بنابراین قادر به تشکیل gRNA یا هدایت مستقیم پروتئین Cas به موقعیت برنامه ریزی شده هستند.

از آنجایی که crRNA ها و پروتئین Cas به ترتیب کنترل کامل ویژگی و کارآیی ویرایش سیستم های CRISPR/Cas را در دست دارند، شناسایی و طبقه بندی سیستم CRISPR/Cas متشکل از انواع مختلف crRNA ها و پروتئین های Cas، ضروری می باشد.

شناخت آرایه های CRISPR که crRNA ها را تولید می کنند

مهمترین جزء سیستم CRISPR/Cas، crRNA است که از آرایه های CRISPR تولید می شود. بنابراین، شناخت آرایه های CRISPR ضروری می باشد. تاکنون روش های محاسباتی مختلفی برای شناسایی آرایه های CRISPR با استفاده از اطلاعات توالی پیشنهاد شده است. یکی از اولین ابزارها، PatScan می باشد که مدتها قبل از استفاده از سیستم CRISPR/Cas در ویرایش ژن استفاده می شد که این ابزار به دنبال قطعات همولوگ با الگوی از پیش تعریف شده است.

با این حال، ابزار PatScan برای تشخیص تکرار عمومی برای CRISPR طراحی شده است و قادر به تشخیص تکرارهای اختصاصی برای CRISPR نمی باشد که منجر به عدم توانایی در تشخیص فاصله ها و تکرارها در کل آرایه CRISPR می شود. بعدها، چندین شناسه خاص CRISPR مانند CRISPRFinder، PILER-CR و CRT معرفی شدند.

تشخیص آرایه‌های CRISPR که crRNA‌ها را تولید می‌کنند

ابزار CRISPRFinder از الگوریتم مبتنی بر درخت برای یافتن حداکثر تکرارها استفاده می کند. علاوه بر این، PILER-CR بر اساس ماتریس هم ترازی، آرایه‌های احتمالی CRISPR را شناسایی می‌کند و از شباهت توالی، حفظ و توزیع طول برای اصلاح آنها استفاده می‌کند.

برخلاف CRISPRFinder و PILER-CR، ابزار CRT به هیچ ساختار داده مرکزی متکی نیست، اما استراتژی اسکن متوالی ساده را اتخاذ می کند که سرعت اجرای بالایی را مستقل از تعداد تکرارها در ژنوم داده شده امکان پذیر می کند. بعدها CRISPRDetect براساس k-mer پیشنهاد شد و با بهبود استفاده از ویژگی های CRISPR loci به ویژه جهش ها، مطرح گردید.

در کنار تنوع تقاضای تحقیق، ابزارهایی وجود دارد که از شناسه‌های اصلی مشتق شده و برای اهداف مختلف طراحی شده‌اند. یکی از محبوب ترین اهداف در حال حاضر، کشف تنوع CRISPR از داده های متاژنومی و طبقه بندی سیستم CRISPR/Cas است.

به دلیل ماهیت تکراری و ناهمگونی جمعیت، جمع‌آوری CRISPR از متاژنوم‌ها با استفاده از ابزارهای اساسی دشوار است. بنابراین، ابزارهای MinCED، MetaCRAST، Crass و metaCRT توسعه یافتند. ابزار MinCED، Crass و MetaCRT همگی براساس ابزار CRT و تشخیص de novo می باشند. علاوه براین، ابزارهای MinCED و Crass نیازمند دانش قبلی در مورد آرایه های CRISPR نمی باشند.

CHOPCHOP یک ابزار تحت وب CRISPR/Cas9 برای ویرایش ژنوم

پیشرفت های عمده در ویرایش ژنوم اخیرا با توسعه روش های TALEN و CRISPR/Cas9 امکان پذیر شده است. سرعت و سهولت اجرای این فناوری ها منجر به ایجاد موجودات جهش یافته و تراریخته شده است. یک مرحله محدود کننده نرخ در به کارگیری موثر روش های TALEN و CRISPR/Cas9 انتخاب و طراحی ساختارهای هدف است.

CHOPCHOP یک ابزار آنلاین برای تسریع فرآیند طراحی می باشد. ابزار CHOPCHOP طیف گسترده ای از ورودی ها را می پذیرد و مجموعه ای از گزینه های پیشرفته را برای انتخاب هدف ارائه می دهد. از الگوریتم‌های هم‌ترازی توالی کارآمد برای به حداقل رساندن زمان جستجو استفاده می‌کند و به طور دقیق اتصال خارج از هدف RNA های راهنما (sgRNA) را پیش بینی می کند.

هر پرس و جو یک تجسم تعاملی از ژن با مکان های هدف کاندید نمایش داده شده در موقعیت های ژنومی آنها و کد رنگی با توجه به امتیازات کیفیت ایجاد می کند. سهولت استفاده و سرعت CHOPCHOP آن را به ابزاری ارزشمند برای مهندسی ژنوم تبدیل کرده است.

همانطور که گفته شد ابزار CHOPCHOP ابزاری مبتنی بر وب می باشد که به کاربران امکان می دهد به راحتی و به سرعت توالی های هدف بهینه CRISPR/Cas9 را در ژن‌های موجودات مختلف انتخاب کنند. برای غلبه بر محدودیت‌های ابزارهای قبلی، ابزار CHOPCHOP طیف وسیعی از ورودی‌ها را می‌پذیرد، از الگوریتم‌های جستجوی دقیق خارج از هدف برای پیش‌بینی ویژگی هر سایت هدف در ژنوم استفاده می‌کند و همه گزینه‌ها را در یک رابط گرافیکی تعاملی نمایش می‌دهد. علاوه بر این، برای تسریع فرآیند اعتبار سنجی، ابزار CHOPCHOP پرایمرهای مخصوص سایت هدف را برای واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) طراحی می کند و آنها را همراه با مکان های محدود در زمینه ژن نمایش می دهد.

ابزار CHOPCHOP سه شکل ورودی را می پذیرد: نام ژن، مختصات ژنومی و توالی DNA. اگر کاربر نام ژنی را ارائه کند، ابزار CHOPCHOP آن را با مراجعه به جداول ژنی از منابع مختلف (مانند UCSC genome browser) به مختصات ژنومی موجود در ارگانیسم مربوطه تبدیل می کند. اگر کاربر مختصات ژنومی را ارائه دهد، به عنوان مثال برای هدف قرار دادن یک اینترون، این مختصات توسط TwoBitToFa، که توالی DNA مربوط به ناحیه ژنومی را بازیابی می کند، تجزیه می شود. اگر کاربر توالی DNA مستقیم را ارائه دهد، این توالی برای تمام سایت‌های هدف بالقوه که الزامات توالی برای جستجوی فعلی را برآورده می‌کنند، اسکن می‌شود.

نتیجه گیری

ابزار CHOPCHOP یک ابزار تحت وب کاربرپسند است که مکان های بهینه CRISPR/Cas9 را برای هر منطقه ژنومی تعیین می کند و اطلاعات را به شیوه‌ای تعاملی و شهودی ارائه می‌کند. ابزار CHOPCHOP، فرآیند طراحی جهش های مبتنی بر CRISPR/Cas9 را با زمان اجرای سریع، پیش بینی قدرتمند و طراحی پرایمر یکپارچه تسریع می کند.

ابزار CHOPCHOP دارای تعدادی ویژگی است که آن را از سایر ابزارهای CRISPR/Cas9 که در حال حاضر موجود هستند، جدا می کند. ابزار CHOPCHOP طیف گسترده ای از ورودی ها را می پذیرد و آن را برای طیف گسترده ای از کاربردها مناسب می کند. ابزار CHOPCHOP یک نمایشگر خروجی گرافیکی پویا ارائه می‌کند که شامل تجسم تعاملی ژن است.

تجسم همه مکان‌های هدف ممکن در مدل ژن، انتخاب کاندید های بهینه را آسان می‌کند. برخلاف اکثر ابزارها، CHOPCHOP طراحی هدف CRISPR/Cas9 را در یک ابزار واحد ادغام می کند. ابزار CHOPCHOP تولید پرایمر خودکار و تجسم مکان محدود را برای ژنوتیپ فراهم می کند. در نهایت، ابزار CHOPCHOP نتایج قابل قبولی را ارائه می دهد که شامل یک فایل GenBank با annotation اگزون ها، اینترون ها و مکان های هدف ژن می باشد. ابزار CHOPCHOP یک فرآیند ساده از ابتدا تا انتهای طراحی جهش یافته ایجاد می کند و یک منبع جدید ارزشمند برای فناوری های ویرایش ژنوم است.

کارآموزی ژن درمانی