وسترن بلاتینگ-بخش دوم -دوبله ژنیران

وسترن بلاتینگ – پارت دوم

الکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید

هدف الکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید و یا همان PAGE جداسازی پروتئین های پروتئین Lysate بر اساس سایز، شکل و یا بار می باشد. برای انجام این کار، پروتئین Lysate درون ماتریکس ژل لود می شود. ماتریکس ژل از حفراتی ساخته شده که پروتئین از لابلای آن می تواند حرکت کند. هرچقدر پروتئین کوچکتر باشد، با سرعت بیشتری نسبت به بقیه از لابلای ماتریکس ژل عبور می کند. همچنین پروتئین هرچقدر بزرگتر باشد زمان بیشتری طول می کشد تا از ماتریکس ژل عبور کند. برای شکل دهی یک ماتریکس ژل، یک عامل پلیمریزه کننده و کاتالیز کننده به محلولی که شامل دو نوع مختلف آکریل آمید یعنی آکریل آمید و بیس آکریل آمید است اضافه می شود. کاتالیست و عامل پلیمریزه کننده شکل گرفتن پلی مرهای تک زنجیره های طولانی آکریل آمید در محلول ژل را سرعت می بخشد. شکل گیری ژل نیاز به حضور بیس آکریل آمید برای تشکیل اتصالات عرضی بین دو مولکول پلی آکریل آمید باهم دارد. این اتصالات موجب بوجود آمدن یک ماتریکس میکروسکوپی و یا یک شبکه می شود که پروتئین ها می توانند از آن عبور کنند. سایز حفره های ایجاد شده در ماتریکس ژل با میزان آکریل آمید استفاده شده نسبت عکس دارد. درصد های پایین آکریل آمید در ژل، حفره های بزرگتری در ماتریکس آکریل آمید تشکیل داده و موجب ایجاد فاصله بیشتر بین پروتئین های بزرگ می شود. برای ایجاد فاصله بیشتر بین پروتئین های کوچک، از درصد های بالاتری از آکریل آمید در ژل استفاده می شود و موجب به وجود آمدن ماتریکسی با حفره های کوچکتر شده و در نتیجه آن پروتئین های کوچک با وزن کم، بیشتر از هم جدا می شوند. در PAGE محلول ژل با محتویات ترکیبات آکریل آمیدی و عامل پلیمریزه کننده و کاتالیز کننده آماده شده و سریعا بین دو صفحه عمودی متصل به هم در کاست ریخته می شود. برای تشکیل چاهک هایی در ژل که پروتئین Lysate در آن ها لود شوند، شانه کوچک پلاستیکی در بالا جاگذاری می شود. با سفت شدن مایع ژل، ساختار منعطف و نازک بین صفحات کاست تشکیل می شود. زمانی که ژل کامل آماده شد، کاست ژل درون تانک قرار می گیرد. درون تانک بافر ریخته می شود تا هدایت الکتریکی داخل آن انجام شود. الکترود منفی در بالای تانک و الکترود مثبت در ته تانک قرار گرفته است. انواع مختلفی ازالکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید و یا PAGE وجود دارد. دو نوع معمول آن عبارت اند از:

1- الکتروفورز غیر دناتوره کننده یا Native PAGE

2-  الکتروفورز دناتوره کننده یا SDS-PAGE

در روش الکتروفورز غیر دناتوره کننده یا Native PAGE پروتئین ها حالت فولد شده و Native خود را حفظ می کنند و در ژل ماتریکس بر اساس شارژ Native، وزن و شکل جدا می شوند. به طور کلی شارژ الکتریکی یک پروتئین حاصل جمع شارژ آمینواسید های آن و شارژ گروه های شیمیایی که تحت عنوان مدیفیکاسیون اضافه شده اند، اندازه گرفته می شود. هرچقدر شارژ پروتئین منفی تر باشد، حرکت پروتئین در طول ماتریکس ژل به سمت الکترود مثبت سریع تر خواهد بود. زمانی که پروتئین ها Native و فولد باشند و Native PAGE ران شود، وزن آن ها همانند شکلشان در حرکت آن ها در طول ژل مؤثر است. پروتئین های کوچک و فشرده در ماتریکس ژل سریع تر حرکت می کنند. در حالی که پروتئین های بزرگ و دراز بسیار آهسته تر حرکت می کنند. بنابراین Native PAGE می تواند جهت ارزیابی شارژ ایجاد شده توسط مدیفیکاسیون شیمیایی، مولکول ها یا پروتئین های اضافه شده به پروتئین Native و بررسی ساختار چهارم پروتئین انجام شود.

در الکتروفورز دناتوره کننده پروتئین ها در حالت دناتوره و آنفولد شده ارزیابی می شوند و جداسازی آن ها در ماتریکس ژل فقط براساس وزنشان انجام می شود. برای دناتوره کردن پروتئین ها یک دترجنت آنیونی تحت عنوان سدیم دودسیل سولفات و یا SDS به آن اضافه می شود. مولکول های SDS به شکل یکنواخت سطح پروتئین ها را با یک شارژ منفی پر می کند. در نتیجه پروتئین هایی با وزن یکسان اما ساختار های متفاوت به یک اندازه در SDS-PAGE حرکت می کنند. در همین راستا پروتئین هایی با وزن یکسان ولی بارهای متفاوت، در طول ژل در مقادیر نزدیک به هم حرکت می کنند. این ویژگی SDS-PAGE آن را مخصوصا مناسب ارزیابی های تغییراتی که روی وزن پروتئین می گذارند، کرده است. مانند مدیفیکاسیون های کووالان که دائمی هستند و یا تغییر در بیان پروتئین. در طول SDS-PAGE، SDS به محلول اولیه ژل، نمونه های پروتئین و بافر جهت اطمینان از ثابت ماندن پروتئین ها به شکل آنفولد و شارژ منفی در طول ران، اضافه می شود. در ادامه این انیمیشن جهت نشان دادن مراحل متعاقب وسترن بلاتینگ، از روش SDS-PAGE استفاده شده است. قبل از ران کردن یک ژل پلی آکریل آمید، محققان نیاز به راهی جهت راحت لود کردن نمونه های پروتئینی درون چاهک هایی که در بافر غوطه ور هستند، دارند و همچنین از طرفی باید بتوانند حرکت پروتئین ها در طول ژل را مشاهده کنند در حالی که پروتئین ها عموما بی رنگ هستند. برای انجام اینکار محلولی تحت عنوان Sample Buffer به پروتئین Lysate اضافه می شود. محلول Sample Buffer شامل ترکیبات افزوده شده ای مانند گلیسرول می باشد که موجب چگال تر شدن Sample Buffer نسبت به Running Buffer می شود و این سنگینی موجب ریخته شدن نمونه ها در ته چاهک ها به جای مخلوط شدنش با Running Buffer می شود. محلول Sample Buffer رنگی با شارژ منفی دارد و عموما از بروموفنل بلو جهت مانیتور کردن پروسه الکتروفورز استفاده می شود. رنگ های Loading Dye که همان رنگ  Sample Buffer می باشد، عموما وزن مولکولی کمتری داشته و به شکل پیشرو و جلوتر از بیشتر پروتئین های نمونه پروتئینی حرکت می کند. زمانی که مخلوط پروتئین Lysate وSample Buffer آماده باشد، نمونه های پروتئینی به مدت خیلی کوتاه دما داده می شوند تا آنفولد شدن پروتئین برای SDS-PAGE تسهیل شود. علاوه بر آن Sample Buffer شامل بتامرکاپتواتانول و DTT می باشد که برای شکسن پیوند های دی سولفیدی استفاده شده و با در هم شکست ساختار چهارم کمک به آنفولد شدن پروتئین می کند. برای ارزیابی وزن مولکولی یک پروتئین پس از الکتروفورز با ژل، نمونه ای تحت عنوان پروتئین Ladder شامل تعدادی پروتئین از پیش رنگ شده با سایز مشخص درون چاهک لود شده و همراه با سایر نمونه های مورد آزمایش ران می شود. استفاده پروتئین Ladder ها با پروتئین های از پیش رنگ شده امکان بررسی حرکت پروتئین در ژل را تسهیل می کند. بعد از لود کردن پروتئین Lysate و Ladder تانک الکتروفورز به منبع تغذیه متصل می شود. زمانی که در طول الکتروفورز نمونه های پروتئینی ران شده و از هم جدا شدند، برای مشاهده مستقیم پروتئین های از هم جدا شده و همچنین استفاده از آن برای وسترن بلاتینگ، ژل رنگ آمیزی می شود. رنگ آمیزی ژل معمولا برای مشاهده حضور همه پروتئین ها انجام می شود. این کار مخصوصا زمانی می تواند مفید باشد که ما نیاز به جداسازی و خالص سازی پروتئین ها با یک وزن مولکولی مشخص داشته باشیم. برخی متد های معمول مورد استفاده برای رنگ آمیزی ژل های پلی آکریل آمید عبارت اند از: رنگ آمیزی کماسی بلو، نیترات نقره و Negative Staining با استفاده از ترکیبات روی.

در قسمت سوم این انیمیشن، فاز دوم وسترن بلاتینگ بررسی خواهد شد

با ما همراه باشید.

همچنین از صفحات زیر دیدن فرمایید:

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه

3 / 5. تعداد رای دهندگان: 4

تا حالا امتیازی برای این مطلب ثبت نشده؛ با ثبت نظرتون مارو خوشحال می‌کنید

2 دیدگاه برای “وسترن بلاتینگ-بخش دوم -دوبله ژنیران

  1. کاربر ژنیران گفته:

    در صورتی که در انالیز وسترن بلات یادمون رفت DTT به sample buffer بزنیم آیا به نتیجه میشه مطمئن بود؟

    • Farbod Esfandi گفته:

      DTT (دی‌تیوتریتول) در انالیز وسترن بلات به عنوان یک عامل کاهنده استفاده می‌شود که پیوندهای دی‌سولفید بین سیستئین‌ها را می‌شکند. این کار به دناتوره کردن پروتئین‌ها و باز کردن ساختار سوم و چهارم آنها کمک می‌کند تا در حین اجرا در ژل SDS-PAGE، پروتئین‌ها بر اساس اندازه‌شان جدا شوند و نه بر اساس شکل یا بار.

      اگر DTT به sample buffer اضافه نشود، پروتئین‌ها ممکن است به طور کامل دناتوره نشوند و ساختارهای ثانویه یا ترشیری خود را حفظ کنند. این امر می‌تواند به چندین مشکل منجر شود:

      مهاجرت ناصحیح در ژل: پروتئین‌هایی که به طور کامل دناتوره نشده‌اند ممکن است با سرعت متفاوتی در ژل حرکت کنند، که این مسئله می‌تواند موجب شود تا اندازه‌گیری‌های نسبت به اندازه واقعی پروتئین نادرست باشد.

      باندهای کم دقت: عدم وجود DTT می‌تواند به باندهای کم وضوح یا نامشخص منجر شود، زیرا پروتئین‌ها ممکن است به صورت اجتماعات یا مولتیمرها باقی بمانند.

      تفسیر دشوار نتایج: نتایج به دست آمده بدون استفاده از DTT ممکن است دشوار به تفسیر باشند و ممکن است بازتاب دقیقی از وضعیت پروتئینی مورد نظر ندهند.

      اگرچه نتایج بدون DTT هنوز می‌توانند اطلاعاتی ارائه دهند، اما معمولاً نمی‌توان به آنها به عنوان نماینده دقیقی از وضعیت پروتئینی اعتماد کرد. بسته به اهمیت آزمایش و نیاز به دقت بالا، ممکن است لازم باشد آزمایش را با افزودن DTT به نمونه‌ها تکرار کنید تا نتایج دقیق‌تر و قابل اعتمادتری به دست آورید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *