تکنیک ها
استخراج و کشت اولیه گلبول های سفید
کشت اولیه سلولی (Primary Culture) به معنای استخراج سلول از یک بافت و کشت آن در محیط in-vitro می باشد. سلول های نرمال به دلیل داشتن life span مشخص و عمر محدود نمی توانند بیش از یک زمان مشخص در محیط آزمایشگاهی رشد کرده و تقسیم شوند. لذا برای انجام تست های مختلف بر روی سلول های نرمال و کشت اولیه سلولی، سلول ها باید جوان بوده و تازه استخراج شده باشند.
ساختار بافت ها با هم متفاوت بوده و بین سلول ها اینتراکشن های مختلف محکم، چسبنده و ارتباطی وجود دارد. همانطور که مبرهن است، سلول های یوکاریوتی به شکل منفصل از هم کشت داده می شوند؛ لذا برای استخراج سلول از بافت و کشت آن در آزمایشگاه نیاز به شکستن اینتراکشن ها و اتصالات بین سلولی می باشد که برای این کار می توان از روش های آنزیمی و مکانیکی استفاده کرد.
بافت خون یک بافت پیوندی سست می باشد که اتصالات بین سلولی در آن ها وجود ندارد و در استخراج سلول های مختلف خونی نیازی به شکستن اتصالات بین سلولی و بافتی نیست. مسئله مهم در استخراج سلول های از خون، توانایی تمییز و خالص سازی بین سلول های مختلف خونی و بدست آوردن رده سلولی خالص می باشد.
سلول های تک هسته‌ای خون محیطی (peripheral blood mononuclear cell) که از دسته آگرانولوسیت ها (agranulocytosis) می باشند نمونه‌ای از سلول های قابل جداسازی از خون هستند. این سلول ها شامل مونوسیت ها، لنفوسیت های T و لنفوسیت های B می باشند.
اگرچه سلول های PBMC با مورفولوژی lymphoblast like در بدن میزبان وجود داشته و معلق در خون هستند؛ انتظار می رود در محیط in-vitro نیز به همین منوال رشد کنند. باید توجه داشت که سلول های ایمنی در مقادیر کم نیز در بافت حضور دارند تا بتوانند ایمنی را در سراسر بدن تأمین کنند. این حضور نشان دهنده چسبندگی جزئی این سلول ها در بافت می باشد (برخی از سلول های ایمنی تک هسته‌ای مولکول های چسبنده ترشح می کنند). در هر صورت سلول های PBMC در محیط in-vitro به شکل نیمه چسبنده (semi adherent) رشد می کنند.
لنفوسیت های B و T در بستر کشت به سمت کف رسوب کرده و تجمع پیدا می کنند. مونوسیت ها نیز در شرایط کشت به شکل بالغ در آمده و به ماکروفاژ تبدیل شده و به کف بستر متصل می شوند. هر دو دسته لنفوسیت ها و مونوسیت ها با یک پیپتاژ ساده از کف جدا شده و در محیط کشت سوسپانس می شوند و نیازی به استفاده از تریپسین برای کندن سلول ها نمی باشد. مجموعاً باید توجه داشت که شرایط کشت سلول های PBMC مشابه شرایط کشت سلول های semi adherent می باشد.
مسئله مهم دیگر خالص سازی سلول و استخراج سلول های PBMC بدون آلودگی های مختلف اعم از گلبول های قرمز، گلبول های سفید دیگر، آلودگی های باکتریایی، قارچی و … می باشد. بدیهی است که خون یک محیط استریل بوده و در صورت سالم بودن فرد دهنده خون به شکل بالقوه هیچ آلودگی خارجی مانند باکتریایی، قارچی و … نخواهد داشت.
لذا برای حذف آلودگی های خارجی کافیست موقع کار شرایط استریل رایج اتاق کشت رعایت شود. همچنین باید توجه نمود که خون یک منبع قوی برای رشد باکتری ها و قارچ ها می باشد و از ریخته شدن خون در سطوح مختلف اتاق کشت به شدت بپرهیزیم. برای خالص سازی PBMC نسبت به سایر سلول های خونی موجود می توان از شیب گرانشی بوجود آمده توسط سانتریفیوژ در حضور یک ترکیب مؤثر القاء کننده این شیب استفاده نمود.
این ترکیب فایکول می باشد. فایکول یک ترکیب خنثی پلی ساکاریدی شاخه شاخه با جرم بالا می باشد. با اضافه نمودن خون به فایکول و سانتریفیوژ آن در دور مناسب، در فاز پایینی گلبول های قرمز و گرانولوسیت ها، در فاز میانی مونوسیت ها، لنفوسیت ها و پلاکت ها و در فاز رویی پلاسما قرار می گیرد.
آزمایشگاه ژنیران با هدف توسعه تکنیکی کارآموزان دوره کشت سلولی، این بخش را به جهت یادگیری مفاهیم کشت اولیه سلولی، استخراج سلول از بافت و شرایط کشت سلول های نیمه چسبنده تبیین کرده است. در این دوره دانشجویان از خون تازه سلول های PBMC را استخراج کرده سپس با رنگ آمیزی فلوروسنت AO/PI سلول ها را مورد بررسی قرار می گیرند. همچنین کارآموزان با نحوه کشت، تعویض محیط و نامیراسازی سلول های نرمال به شکل تئوری آشنا می شوند.
ایاPbmcبرای همه کسانی که ای وی اف میخوان بکنن اجازه دارن انجام بدن یانه
پی ارپی بهتره یاpbmc?
اگر برای جوان سازی رحم می خواهید از prp استفاده کنید، توصیه می کنم با یک پزشک متخصص مشاوره داشته باشید.
سلام میشه گلبول سفید که زیادترازعددنرمالش هست رو ازخون جداکرد؟
جداسازی اجزای تشکیل دهنده خون (که گلبولهای سفید هم جزئی ازآن میباشد)از طریق روشهای اختصاصی و غیر اختصاصی انجام میگیرد
مسئله مهم دیگر خالص سازی سلول و استخراج سلول های PBMC بدون آلودگی های مختلف اعم از گلبول های قرمز، گلبول های سفید دیگر، آلودگی های باکتریایی، قارچی و … می باشد
کشت گلبولهای سفید چقد طول میکشه و طول عمرشون چقدر هست؟
سلام.
بسته به کانفلئونسی حداقل 24 ساعت اول چک باید بشه.
دوره استخراج و کشت اولیه گلبول های سفید از لحاظ علمی کیفیتش بالا بود.ممنون از همه دست اندرکاران این آزمایشگاهی
سلام دوست عزیز . ممنون از دیدگاهتون
من از طریق دختر داییم با این مجموعه آشنا شدم که خیلی سطح اطلاعاتش بالا بود و همین رو برا رشته من که میکروبیولوژی خوندم معرفی کرد و جدیدا ثبتنام کردم
سلام دوست عزیز . ممنون از دیدگاه شما
در این دوره کارآموزی من با مطالبی هم چون نحوه کشت، تعویض محیط و … آشنا شدیم و مطالب ارزنده و خوبی بود
سلام دوست عزیز . ممنون از دیدگاهتون
با توجه به خونگیری و بررسی های مورد نظر در این آزمایشگاه هم تجهیزات کامل بوده و هم نتایج خوبی از این نوع نمونه گیری ها به دست اومده که مسبب یادگیری درست در ما دانشجویان شده
مسئله مهم در استخراج سلول های از خون، خالص سازی بین سلول های مختلف خونی هست و بدست آوردن رده سلولی خالص می باشد که در این دوره استخراج و کشت اولیه گلبول های سفید کامل این مراحل طی میشه
عرض سلام واحترام بسیارسپاسگزارازویدئوهای آموزشی عالی وکاربردی که دراختیارمون قراردادید.
سلام
ایا فایکول برای استخراج خون های قدیمی موثر و خوب هستند؟
سلام .
خیر اگر pbmc میخواهید کشت بدهید امکان پذیر نیس
با سلام و تشکر بابت کلیپ آموزشی پربار و مفیدتون
سلام دوست عزیز . ممنون از دیدگاهتون