تست Carba NP چیست؟
تست Carba NP یک آزمایش بیوشیمیایی برای تشخیص سریع (کمتر از 2 ساعت) تولید کارباپنماز (Carbapenemase) در باسیل‌های گرم منفی است. موسسه استانداردهای بالینی و آزمایشگاهی (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)) تست Carba NP را برای اطمینان از تولید کارباپنمازها در انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae)، سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa) و گونه‌های اسینتوباکتر (Acinetobacter) از طریق بررسی MIC کارباپنم‌های (carbapenem) افزایش یافته یا کاهش نواحی مهار انتشار دیسک (Disk diffusion)، برای اهداف اپیدمیولوژیک یا کنترل عفونت توصیه می‌کند.
CNPt برای تشخیص کارباپنماز کلبسیلا پنومونیه (Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)) و متالو بتالاکتاماز (Metallo-beta-lactamase (MBL)) بسیار حساس است اما در تشخیص کارباپنماز OXA-48 like حساسیت کمتری دارد.
اصول تست Carba NP
هنگامی که لیزات باکتریایی (Bacterial lysate)، ایمی‌پنم (Imipenem) را هیدرولیز می‌کند، یک افتراق کربوکسیلیک (Carboxylic) تشکیل می‌شود که pH محیط را کاهش می‌دهد. این تغییر در pH توسط یک نشانگر pH، با تغییر رنگ محیط از قرمز به زرد تشخیص داده می‌شود.
نیازمندی‌های تست
این تست نیاز به آماده‌سازی جداگانه چند محلول دارد.
محلول A: محلول غلیظ 0.5% وزنی-حجمی فنول رد با 0.1 میلی‌مول در لیتر ZnSO4
- محلول غلیظی از 0.5% وزنی-حجمی فنول رد (0.5 گرم در 100 میلی‌لیتر آب مقطر) تهیه کنید.
- 2 میلی‌لیتر محلول غلیظ فنول رد (قبل از پیپت کردن (Pipette) به شدت با ورتکس (Vortex) هم بزنید تا محلول دوباره معلق شود) را با 16.6 میلی‌لیتر آب مقطر مخلوط کنید.
- PH را با استفاده از قطره‌های محلول 1N هیدروکسید سدیم (NaOH) روی 7.8 تنظیم کنید.
- 180 میکرولیتر از سولفات روی (ZnSo4) 10 میلی مولار را اضافه کنید تا غلظت نهایی به 0.1 میلی‌مولار برسد.
توجه: این محلول را می‌توان در دمای اتاق به مدت 1 هفته و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد برای ماه‌ها تهیه و استفاده کرد.
محلول B: محلول A + 6 میلی‌گرم در میلی‌لیتر ایمی‌پنم
دسته‌های محلول پودر ایمی‌پنم را در صورت عدم مخلوط کردن با محلول A می‌توان از قبل در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 هفته نگه‌داری کرد.
بافر لیز 20 میلی‌مولار Tris-HCl
روش تست Carba NP
- 100 میکرولیتر از بافر لیز (Lysis) 20 میلی مولار Tris-HCl (موجود به صورت تجاری) را به هر دو لوله 1.5 میلی‌لیتری اپندورف (Eppendorf) اضافه کنید.
- 10 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی را در هر یک از آن 2 لوله اپندورف قرار دهید. اطمینان حاصل کنید که کلنی‌های باکتری با استفاده از پیپت مجدداً معلق شده یا با هم مخلوط شده‌اند.
یا،
به عنوان یک پیشنهاد دیگر، کلنی‌های باکتریایی که یک شبه روی MHA رشد کرده‌اند را می‌توان با استفاده از یک لوپ (Loop) لایه برداری کرد و در 100 میکرولیتر از بافر لیز 20 میلی مولار Tris-HCl که با استفاده از دستگاه ورتکس به مدت 5 ثانیه مخلوط شده است، ساسپند کرد.
- 100 میکرولیتر محلول A را به ترتیب به اولین و 100 میکرولیتر از محلول B (محلول A + 6 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر ایمی‌پنم) را در دومین لوله اپندورف اضافه کنید.
- هر دو لوله را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد حداکثر به مدت 2 ساعت انکوبه کنید.
- تغییر رنگ را در هر دو لوله بررسی و بر اساس آن، نتیجه را تفسیر کنید.
تفسیر تست Carba NP
تست Carba NP با تغییر رنگ محلول قرمز اصلی در هر دو لوله تفسیر می‌شود.
| رنگ در لوله A (بدون آنتی‌بیوتیک) | رنگ در لوله B (با ایمی‌پنم) | تفسیر |
| قرمز | قرمز | غیر تولید کننده کارباپنماز |
| قرمز | نارنجی/ زرد | تولید کننده کارباپنماز |
| زرد | زرد | غیر قابل تفسیر |
معمولاً زمان لازم جهت رسیدن به نتایج مثبت برای انواع مختلف کارباپنماز، متفاوت است.
| نوع کارباپنماز | دوره زمانی برای نتیجه مثبت |
| تولیدکنندگان KPC | 2 تا 30 دقیقه |
| تولیدکنندگان OXA-48 like | 20 دقیقه تا 1 ساعت |
| متالو بتالاکتامازها (NDM، VIM، IMP) | 15 دقیقه تا 1 ساعت |
اصلاح تست Carba NP
بسیاری از واریانت‌های تست Carba NP از زمان معرفی تا کنون با تغییراتی در اندازه تلقیح، شناساگر‌های استخراج، pH اولیه، اندیکاتور‌های pH و زمان خواندن همراه بوده‌اند.
- تست Blue Carba از نشانگر pH بروموتیمول بلو (Bromothymol blue) استفاده می‌کند.
- تست اصلاح شده Carba NP نوع دیگری است که از بافر لیز 0.02% ستیل‌تری‌متیل‌آمونیوم برومید (Cetyltrimethylammonium bromide) و pH اولیه 7.5 به جای 7.8 استفاده می‌کند که امکان شناسایی تولید کننده کارباپنماز را بهبود داده است. این تست کارباپنمازهای نوع OXA 48 را نیز تا حدودی شناسایی می‌کند.
- تست Carba NP II اصلاح دیگری است که هم تولید کارباپنماز را مشخص می‌کند و هم طبقه‌بندی کارباپنماز تولید شده را مشخص می‌کند. این تست وابسته به تغییرات pH ناشی از هیدرولیز ایمی‌پنم در ارتباط با مهار آنزیمی اختصاصی از طریق استفاده از تازوباکتام (Tazobactam) جهت شناسایی KPC و استفاده از EDTA جهت تشخیص MBL می‌باشد.
- تست Carb Acineto NP یکی دیگر از واریانت‌های طراحی شده برای غلبه بر مشکلات تست اصلی با شناسایی کارباپنمازهای تولید شده توسط baumannii می‌باشد. این تست به شرایط لیز اصلاح شده و افزایش تلقیح باکتریایی در مقایسه با تست اصلی Carba NP نیاز دارد.
محدودیت‌های تست Carba NP
- اگرچه نتایج سریع به دست می‌آیند، این تست نیاز به آماده‌سازی شناساگر‌های تازه (محلول حاوی ایمی‌پنم) دارد که حداکثر ماندگاری آن‌ها ۷۲ ساعت است و باید به طور مناسب ذخیره‌سازی شده باشند.
- قادر به شناسایی سویه‌های تولید کننده نوع OXA-48 نیست.
همچنین بخوانید:
- تست لیتموس میلک (Litmus Milk Test): اصول، روش، و نتایج
- تست فهلینگ (Fehling’s Test): تعریف، اصول، روش، نتیجه و موارد استفاده
- تست مونواسپات: اصول، روش و موارد استفاده
- تست ویدال: مقدمه، اصول، روش استفاده، تفسیر نتایج و محدودیتها
- تست رزبنگال (RBT) برای بروسلا
مترجم: صادق حسینی‌کیا
