مقدمه‌ای بر رنگ آمیزی اندوسپور
در سال 1922، Dorner روشی را برای رنگ آمیزی اندوسپورها ارائه داد. Shaeffer و Fulton روش Dorner را در سال 1933 اصلاح کردند تا این فرآیند را سریعتر کنند. رنگ اندوسپور یک رنگ افتراقی است که به طور انتخابی اندوسپورهای باکتریایی را رنگ می‌کند. هدف اصلی از رنگ آمیزی اندوسپور، افتراق اسپورهای (Spore) باکتری از سایر سلول‌های رویشی و افتراق ارگانیسم‌های تشکیل دهنده اسپور از غیر اسپور است.
اصول روش رنگ آمیزی اندوسپور
اندوسپورهای باکتریایی، ساختارهای متابولیکی غیرفعال و بسیار مقاومی هستند که توسط برخی باکتری‌ها به عنوان یک استراتژی دفاعی در برابر شرایط محیطی نامطلوب تولید می‌شوند. باکتری‌ها می‌توانند در این حالت باقی بمانند تا زمانی که شرایط مساعد شود و بتوانند جوانه زده و به حالت رویشی خود بازگردند.
در روش Schaeffer-Fulton، یک رنگ اولیه به نام مالاشیت گرین (Malachite green) با بخار دادن امولسیون باکتری به داخل اسپور وارد می‌شود. مالاشیت گرین قابل حل در آب است و میل ترکیبی کمی با مواد سلولی دارد، بنابراین سلول‌های رویشی ممکن است با آب بی‌رنگ شوند. سپس سافرانین (Safranin) برای رنگ آمیزی ثانویه سلول‌هایی که رنگ‌زدایی شده‌اند به کار می‌رود. در پایان فرآیند رنگ آمیزی، سلول‌های رویشی صورتی و اندوسپورها سبز تیره می‌شوند.
اسپورها ممکن است در وسط سلول، در انتهای سلول یا بین انتهای و وسط سلول قرار گیرند. شکل اسپور ممکن است برای تشخیص بیماری نیز مفید باشد. اسپورها ممکن است کروی یا بیضوی باشند.
شناساگرهای مورد استفاده برای رنگ آمیزی اندوسپور
رنگ آمیزی اولیه: مالاشیت گرین (محلول آبی 0.5 درصد (وزنی/حجم))
- 5 گرم مالاشیت سبز
- 100 میلی‌لیتر آب مقطر
عامل رنگ‌زدا
- آب لوله‌کشی یا آب مقطر
رنگ ثانویه: سافرانین
- محلول ذخیره (محلول الکلی 2.5% (وزنی/حجمی))
- 5 گرم سافرانین O (Safranin O)
- 100 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد
روش رنگ آمیزی اندوسپور
- یک لام تمیز بدون چربی بردارید و با استفاده از یک تکنیک استریل، اسمیر را به آن اضافه کنید.
- آن را با هوا خشک کنید و با حرارت ارگانیسم را روی یک لام شیشه‌ای ثابت کنید. سپس با یک کاغذ خشک‌کن مربعی یا یک تکه پارچه حوله‌ای روی لام را بپوشانید.
- کاغذ خشک‌کن را به محلول رنگ مالاشیت گرین آغشته کنید و به مدت 5 دقیقه بخار دهید. کاغذ را مرطوب نگه دارید و در صورت نیاز رنگ بیشتری به آن اضافه کنید. یک راه دیگر این است که اسلاید را می‌توان روی یک ظرف آب جوش، بخار داد.
- لام را با آب لوله‌کشی بشویید.
- با رنگ ثانویه سافرانین 0.5 درصد به مدت 30 ثانیه رنگ کنید. سپس آن را با آب لوله‌کشی بشویید و رنگ را خشک کنید.
- لام را زیر میکروسکوپ از نظر وجود آندوسپور بررسی کنید. اندوسپورها سبز روشن و سلول‌های رویشی قرمز مایل به قهوه‌ای تا صورتی هستند.
نتایج روش رنگ آمیزی اندوسپور
- اندوسپورها: اندوسپورها سبز روشن هستند.
- سلول‌های رویشی: سلول‌های رویشی قرمز مایل به قهوه‌ای تا صورتی هستند.
اسپورها ممکن است در وسط سلول، در انتهای سلول یا بین انتها و وسط سلول قرار گیرند. شکل اسپور ممکن است برای تشخیص بیماری نیز مفید باشد. اسپورها ممکن است کروی یا بیضوی باشند.
رنگ آمیزی اندوسپور به روش Dorner
رنگ کربول فوشین (Carbol fuchsin)
- 3 گرم فوشین بازی (Basic fuchsin)
- 10 میلی لیتر اتانول، 95٪ (vol/vol)
- 5 میلی‌لیتر فنل (Phenol) (کریستال‌های ذوب شده با حرارت)
- 95 میلی‌لیتر آب مقطر
فوشین بازی را در اتانول حل کنید. سپس فنل حل شده در آب را اضافه کنید.
مخلوط کنید و بگذارید چند روز بماند. قبل از استفاده فیلتر کنید.
حلال رنگ‌زدا (اسید الکل)
- 97 میلی‌لیتر اتانول، 95 درصد (حجمی/حجمی)
- 3 میلی‌لیتر اسید کلریدریک (غلیظ)
رنگ ثانویه (محلول نیگروسین (Nigrosin))
- 10 گرم نیگروسین
- 100 میلی‌لیتر آب مقطر
روش
- یک لام تمیز غیر چرب بردارید و با استفاده از یک تکنیک استریل اسمیر را به آن اضافه کنید.
- آن را با هوا خشک کنید و با حرارت ارگانیسم را روی یک لام شیشه‌ای ثابت کنید. سپس با یک کاغذ خشک‌کن مربعی یا یک تکه پارچه حوله‌ای روی اسلاید را بپوشانید.
- کاغذ خشک‌کن را به کربول فوشین آغشته کنید و به مدت 5 تا 10 دقیقه بخار دهید، کاغذ را مرطوب نگه دارید و در صورت نیاز رنگ بیشتری به آن اضافه کنید. یک راه دیگر این است که لام را می‌توان روی یک ظرف آب جوش، بخار داد.
- کاغذ خشک‌کن را بردارید و فیلم را با اسید الکل به مدت 1 دقیقه رنگ آمیزی کنید. سپس آن را با آب لوله‌کشی بشویید و با رنگ را خشک کنید.
- سپس یک قطره نیگروزین را در یک سر یک لام بریزید و با کمک لام دیگری یک لایه نازک از رنگ در سراسر اسمیر ایجاد کنید.
- اجازه دهید فیلم نیگروزین در هوا خشک شود.
- پس از خشک شدن در هوا، لام را با استفاده از روغن ایمرسیون (Oil immersion) و میكروسكوپ نوری بررسی کنید.
سلول‌های رویشی بی‌رنگ، اندوسپورها قرمز رنگ و زمینه آن سیاه می‌باشد.
نمونه‌هایی از رنگ آمیزی اندوسپور
مثبت
- کلستریدیوم پرفرنجنس (Clostridium perfringens)
- کلوستریدیوم بوتولینوم (C. botulinum)
- کلستریدیوم تتانی (C. tetani)
- باسیلوس آنتراسیس (Bacillus anthracis)
- باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus)
- گونه‌های دسولفوتوماکولوم (Desulfotomaculum)
- گونه‌های اسپورولاکتوباسیلوس (Sporolactobacillus)
- گونه‌های اسپوروسارسینا (Sporosarcina) و غیره.
منفی
کنترل کیفیت رنگ آمیزی اندوسپور
- کنترل مثبت: کلستریدیوم پرفرنجنس (ATCC 13124)
- کنترل منفی: اشریشیا کلی (ATCC 25922)
همچنین بخوانید:
- رنگ های رومانوفسکی: اصول، انواع، کاربردها
- رنگ‌آمیزی تریکروم ماسون (Masson’s Trichrome Staining): اصول، اهداف، آماده‌سازی، تفسیر نتایج و محدودیت‌ها
- آموزش رنگ آمیزی گرم
- رنگ آمیزی سلول: رنگ‌آمیزی اختصاصی سلولی برای تشخیص تمایز
- رنگ آمیزی کالکوفلور سفید: اصول، روش، نتایج و کاربردها
- رنگ آمیزی اسید فست (Acid-Fast Stain): اصول، روش، تفسیر و مثال‌ها
مترجم: صادق حسینی‌کیا
