تعیین غلظت پروتئین ها به روش بیوره

عموما برای تعیین غلظت پروتئین ها از روش طیف سنجی فرابنفش- مرئی استفاده میشود. این روش با استفاده از کروموفور های ذاتی موجود در پروتئین نظیر گروهای آروماتیک که دارای جذب در 280 نانومتر هستند یا پیوند های پپتیدی که دارای جذب در 230نانومتر هستند یا از طریق برهمکنش پروتئین با معرف های گوناگون که ایجاد محلول رنگی میکنند و یا با اتصال رنگ های خاصی به پروتئین انجام میشود. هریک از روش های سنجش برای تعیین غلظت دارای مزایا و معایبی هستند. انتخاب یک روش سنجش برای تعیین غلظت پروتئین دارای معیارهای گوناگونی است که بر اساس نوع کار انتخاب میشود.

از معیار های مهم میزان حساسیت سنجش حلالیت پروتئین وحذف ترکیبات مزاحم است که باید مورد توجه قرار گیرد.انواع روش ها وجود دارند که در این مقاله به روش بیوره میپردازیم.

بیوره شامل یک معرف قلیایی مس است که با پروتئین ایجاد کمپلکس کرده و رنگ ارغوانی ایجاد میکند.مس در محلول قلیایی با اتم های نیتروژن پیوند های پپتیدی ایجاد پیوند میکند. از آنجایی که مس با پیوند های پپتیدی در ارتباط هست هرچه تعداد اسید آمینه های در گیر در پیوند پپتیدی بیشتر باشد سنجش قوی تر است از این رو این روش برای سنجش غلظت های پروتئین های کوچک دارای حساسیت کمی است.

برای تعیین غلظت پروتئین در مرحله اول باید خود مجلول بیوره ساخته شود اجزای محلول بیوره عبارتند از:

0.15 درصد وزنی حجمی از آب و CU  (0.375گرم در 250 میلی لیتر)

0.6 درصد وزنی حجمی تارتارات سدیم و پتاسیم (1.5 گرم در 250 میلی لیتر)

3 درصد وزنی حجمی سود (5/7 گرم در 250 میلی لیتر )

محلول بیوره چندین ماه پایدار است اگه رنگ این محلول در طول زمان نارنجی شود نشانه از دست رفتن خاصیت آن است از این رو بهتر است که یک گرم یدید پتاسیم به عنوان ضد اکسیدان به یک لیتر معرف اضافه شود. برای هربار سنجش 5/2 میلی لیتر محلول بیوره به 0.5 میلی لیتر محلول پروتئین که حاوی 1 تا 15 میلی گرم پروتئین است افزوده میشود.

پس از مخلوط کردن آنرا به مدت نیم ساعت در درجه حرارت اتاق انکوبه کرده سپس میزان جذب در طول موج های 540 یا 570 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر اندازه گیری میشود البته برای حذف مزاحمت هایی مثل آمونیوم مقدار جذب در طول موج 310 نانومتر هم مناسب است .

ابتدا لازم است که یک منحنی کالیبراسیون برای یک پروتئین خالص مانند سرم آلبومین با مقادیر معلوم در حد میلی گرم رسم شود. سپس پروتئین هایی با غلظت مجهول در حد میلی گرم را میتوان با روش بیوره با تطبیق نسبت به منحنی کالیبراسیون کرد .