طراحی پرایمر: آموزش مرحله به مرحله

فهرست مطالب نمایش

معرفی

این مقاله نحوه طراحی پرایمرهای (فروارد و معکوس) برای انواع مختلف روشهای شبیه سازی را نشان می‌دهد.

طراحی پرایمر با استفاده از ژن Dsup (سرکوب کننده آسیب) از tardigrade نشان داده شده است. Tardigrades حیواناتی جذاب با توانایی‌ خارق‌العاده تحمل شرایط شدید محیطی مانند خلاء فضا، تحمل بالا در برابر اشعه ماوراء بنفش، تحمل دمای بالا و پایین برای شروع هستند. پروتئین Dsup یک ژن تازه کشف شده است که با پوشاندن خود به DNA مقاومت در برابر اشعه UV ایجاد میکند.

برای تکثیر هر توالی DNA، دو آغازگر (پرایمر) لازم است. یکی «پرایمر فروارد یا جلو» و دیگری «پرایمر معکوس» نام دارد. پرایمر فوروارد رشته بالایی را با استفاده از رشته پایین به عنوان الگو، سنتز میکند. در حالی که پرایمر معکوس از رشته بالایی به عنوان الگو استفاده میکند و رشته پایین را سنتز میکند.

اگرچه نامشان نشان می‌دهد که آنها کپی‌هایی از رشته های مختلف ایجاد می کنند ولی نام آنها به جهت رشته ای که برای تکثیر استفاده می‌شود بستگی دارد.

پرایمر فوروارد کپی‌هایی از رشته 5′-3′ ایجاد می‌کند در حالی که پرایمر معکوس از رشته مکمل (3′-5′ اجرا می‌شود) کپی می‌کند.

اگر توالی رشته مکمل را بگیرید و از آن برای طراحی پرایمر استفاده کنید (توالی را در 5′-3′ قرار دهید)، پرایمر معکوس در مثال بالا اکنون به عنوان پرایمر جلو عمل می‌کند.

ما از نرم افزار APE (A Plasmid Editor) برای طراحی پرایمرها استفاده می کنیم که استفاده از آن رایگان است.

حتی اگر از ابزار دیگری استفاده کنید، مراحل طراحی پرایمر ثابت میماند.

طراحی پرایمر فروارد

مراحل در طراحی پرایمر فروارد

ما توالی نوکلئوتیدی ژن Dsup را از پورتال NCBI (که در بالا ذکر شد) کپی کردیم و آن را در APE قرار دادیم. از کدون شروع (ATG) شروع میشود و به کدون پایان (TAA) ختم می‌شود. توالی ژن از جهت 5 به 3 است. لطفاً توجه داشته باشید که تنها یک رشته از DNA در اینجا نشان داده شده است. برخی از ابزارها مانند snapgene هر دو رشته را نشان می‌دهند.
پرایمر فوروارد با انتخاب توالی نوکلئوتیدی از ATG طراحی می‌شود تا زمانی که پارامترهای آغازگر مانند محتوای GC و Tm (دمای ذوب) با پارامترهای طراحی آغازگر مطابقت داشته باشند.

می توانید چندین پارامتر از دنباله انتخاب شده را از قسمت نوار ابزارها (جعبه قرمز) مشاهده کنید. پارامترها قابل تغییرند، بنابراین می توانید نوکلئوتیدها را برای مطابقت با معیارهای مورد نیاز انتخاب یا از حالت انتخاب خارج کنید.

برای اکثر موارد، Tm ترجیحی بین 55-62 درجه سانتیگراد و محتوای GC= 40-60٪ است.

در مثال ذکر شده در بالا، طول پرایمر 20 نوکلئوتید، Tm 56.8 درجه سانتیگراد (~57 درجه سانتیگراد) و محتوای GC= 50٪ است. بنابراین، این دنباله میتواند به عنوان یک پرایمر فوروارد عمل کند. همچنین، دنباله با C به پایان میرسد که مفید است زیرا هنگامیکه پلیمراز روی اتصال پرایمر کار می‌کند محکم تر است.
از آنجایی که توالی از جهت 5 به3 است، پرایمر فوروارد را میتوان مستقیماً سفارش داد. بنابراین دنباله پرایمر فوروارد برای سفارش “ATGGCATCCACACACACCAATC” است.
لطفاً توجه داشته باشید که ما آن را به عنوان- ATGGCATCCACACACCAATC-3′ -5 ذکر نمیکنیم. این یک قانون است که توالی‌های DNA باید در 5′-3′ ذکر شوند در حالی که توالی‌های پروتئین باید از ترمینال N-C ذکر شوند.
تصویر زیر (شکل 2) ایده خوبی از نحوه طراحی پرایمر فوروارد و نحوه استفاده از آن در واکنش PCR می‌دهد.

نحوه طراحی پرایمر فوروارد و نحوه استفاده از آن در واکنش PCR — شکل 2. تصویری که طراحی پرایمر فوروارد و دخالت آن در PCR را نشان می‌دهد. 2.1 مارپیچ دوگانه DNA به رنگ سبز نشان داده شده است. دنباله پوشیده شده در مستطیل باز آبی برای پرایمر معکوس استفاده می‌شود. روبان آبی نشان دهنده پرایمر است. 2.2 DNA دوبلکس در واکنش PCR باز می‌شود. 2.3 اتصال پرایمر به رشته مکمل. 2.4 گسترش پرایمر ایجاد رشته بالایی (5′-3′).

طراحی پرایمر معکوس

طراحی پرایمر معکوس فرآیندی نسبتا پیچیده است. مشکل از این واقعیت ناشی می‌شود که از این طریق توالی‌های DNA را به هم ارتباط میدهیم. مشکل دیگر این است که باید با رشته الگو کار کنیم تا برای رشته دیگر پرایمر طراحی کنیم.
هر مشکلی که باشد، با کمک ابزارهایی مانند APE، طراحی پرایمر معکوس تنها با یک کلیک انجام میشود. مراحل ذکر شده در زیر را برای به دست آوردن توالی پرایمر معکوس مطالعه کنید.
پرایمر معکوس از انتهای دنباله‌ای که به APE اضافه کرده ایم طراحی شده است.
یک نکته حیاتی که باید در نظر داشت این است که آیا کدون پایان در پرایمر گنجانده میشود یا خیر. به عنوان مثال، اگر میخواهید یک برچسب یا مارکر (پروتئین فلورسنت یا یک پپتید کوتاه و غیره) به پایانه C پروتئین اضافه کنید، باید کدون پایان را از پرایمر معکوس بردارید تا اجازه دهید برچسب در حین ترجمه ذوب شود. اگر هدف شما کلونینگ ژن یا بیان پروتئین بدون برچسب در ترمینال C ژن است، باید کدون پایان را برای جلوگیری از همجوشی هنگام ترجمه توالی‌های ناقل، وارد کنید. در این تصویر، کدون پایان را در نظر میگیریم.
درست مانند پرایمر فوروارد، توالی تا زمانی تست و انتخاب شد که پارامترهایی مانند محتوای GC و Tm با مقادیر مورد نظر مطابقت داشته باشد. این یک تمرین خوب است که پارامترها (محتوای Tm و GC) را تا حد امکان نزدیک به پرایمر فوروارد و معکوس نگه دارید (شکل 3).

طراحی پرایمر فوروارد و معکوس — شکل 3. توالی انتخاب شده برای طراحی پرایمر فوروارد (متن با رنگ آبی برجسته شده است که با نوک پیکان نشان داده شده است). کادر قرمز پارامترهای دنباله انتخاب شده مانند Tm، طول توالی و GC را نشان می‌دهد.

از آنجایی که توالی الگو از جهت 5 به 3 است، پرایمر معکوس را نمی توان مستقیماً سفارش داد. نیاز به تکمیل معکوس دارد.
برای معکوس کردن ، توالی را کپی کنید (ctrl+c یا cmd+c) و (ctrl+v یا cmd+v) در پنجره جدید قرار دهید(شکل 4.1). یک دکمه در قسمت نوار ابزار APE وجود دارد تا توالی را به توالی مکمل آن تبدیل کند. توالی پرایمر را انتخاب کنید (اگر قبلا انتخاب نشده باشد) و روی دکمه کلیک کنید (شکل 4.2).

شکل 4. تصویری که مراحل مربوط به مکمل معکوس را در نرم افزار APE نشان می‌دهد. 4.1 دکمه ایجاد یک فایل/پنجره جدید. 4.2 دکمه برای مکمل کردن توالی معکوس.

بررسی کنید که آیا دنباله معکوس مکمل شده است یا خیر.
قبل از مکمل معکوس توالی ’ CTGGAGGACGGAAGAGGAAGTAA-3’-3 و بعد از مرحله مکمل سازی و معکوس به صورت ’-TTACTTCCTCTTCCGTCCTCCAG-3’5 است.
از طرف دیگر، می‌توانید بدون کپی پیست کردن توالی در یک پنجره جدید، توالی را معکوس کنید. اما ما آن را توصیه نمی کنیم زیرا توالی اصلی فایل را تغییر می‌دهد.
DNA دو رشته‌ای در جهت 5 به 3 با جفت باز مکمل A=T و G=C اجرا می‌شود. همانطور که ما فقط یک رشته DNA (رشته 5′ – 3′) را نشان دادیم، توالی پرایمرهای معکوس باید از آن استخراج شود.
همانطور که قبلاً ذکر شد، نشان دادن توالی DNA یک مفهوم کلی است. اگر یک توالی DNA را به شرکت سنتز پرایمر ارائه دهید، آنها همیشه فرض میکنند که توالی را در جهت 5′-3′ نوشته اید و به همان ترتیب سنتز می‌شود. اگر توالی انتخاب شده را معکوس نکنید (از رشته بالایی / رشته 5′-3′)، یک پرایمر فوروارد دیگر دریافت خواهید کرد که از انتهای ژن مورد نظر شما شروع می‌شود (شکل 5).

شکل 5. تصویری که اهمیت مکمل معکوس را نشان می‌دهد. 5.1 مارپیچ دوگانه DNA به رنگ سبز نشان داده شده است. توالی پوشیده شده در مستطیل آبی برای پرایمر معکوس استفاده می‌شود. 5.2 DNA دو رشته‌ای در واکنش PCR از هم باز می‌شود. 5.3 اتصال پرایمر به رشته مکمل و گسترش پرایمر. پلیمریزاسیون منجر به سنتز رشته بالایی (5′-3′) می‌شود. این عمل معادل عمل پرایمر فوروارد است.

مکمل معکوس دو مرحله دارد.

توالی مکمل، توالی رشته مخالف است اما در یک جهت اجرا می‌شود. به عنوان مثال، توالی مکمل

ATGC-3’به 5′-TACG-3′-5 تبدیل خواهد شد. اعمال همین اصل برای توالی انتخاب شده برای پرایمر یعنی CTGGAGGACGGAAGAGGAAGTAA-3’-5 منجر به

GACCTCCTGCCTTCTCCTTCATT-3’-5 می‌شود. توالی مکمل به دلیل عدم جفت شدن نمیتواند به هیچ یک از رشته ها متصل شود.

بنابراین، مرحله دوم شامل معکوس کردن جهت دنباله مکمل است. معکوس کردن جهت به سادگی 5′ را به 3′ تغییر می‌دهد و بالعکس. این باعث می‌شود TACG-3′ -5به 3′-TACG-5′-5 تبدیل شود. همانطور که قبلاً بحث شد، توالی‌های DNA باید در جهت 5′-3′ نوشته شوند. بنابراین توالی از TACG-3′-5 به GCAT-3′-5 تغییر می‌کند. استفاده از همان اصل برای توالی پرایمر ما که توالی را از GACCTCCTGCCTTCTCCTTCATT-3′-5 به TTACTTCCTCTTCCGTCCTCCAG-3′-5 تغییر می‌دهد.

همین فرآیند به عنوان تصویر زیر نشان داده شده است (شکل 6).

فرایند مکمل معکوس — شکل 6. تصویری که طراحی پرایمر معکوس و دخالت آن در PCR را نشان می‌دهد. 6.1 مارپیچ دوگانه DNA به رنگ سبز نشان داده شده است. توالی پوشیده شده در مستطیل آبی برای پرایمر معکوس استفاده می‌شود. روبان آبی نشان دهنده توالی پرایمر انتخاب شده برای طراحی پرایمر معکوس است. مکمل معکوس شامل دو مرحله (تکمیل و تغییر جهت) نشان داده شد. 6.2 DNA دو رشته ای در واکنش PCR باز می‌شود. پرایمر به رشته بالایی (5′-3′) متصل می‌شود. جهت پلیمریزاسیون به سمت پایه قالب است که بیشتر از توالی خارج است همانطور که بدون تکمیل معکوس اتفاق می افتد. 6.3 گسترش پرایمر در رشته پایینی (3′-5′).

پارامترهای طراحی پرایمر

هنگام طراحی پرایمر دستورالعملهای خاصی وجود دارد که باید رعایت کنید. برخی از آنها قبلاً مورد بحث قرار گرفتند (Tm و GC٪). بقیه موارد عبارتند از:

طول پرایمر معمولا 12 باز تا 30 باز است. 30 باز اشتباه نیست، اما نشان دهنده افزایش احتمال سازه‌های ثانویه است.
پرایمرهای فوروارد و معکوس نباید اختلاف Tm بیش از 5 درجه سانتیگراد داشته باشند.

اگر نمی‌دانید که چگونه Tm را محاسبه کنید، در اینجا فرمول وجود دارد:

2(A+T)+4(G+C) یا 2(wA+xT)+ 4(yG+zC)

(w,x,y, و z تعداد باقی مانده‌های نوکلئوتیدی متناظر در توالی آغازگر داده شده است).

Tm دمایی است که در آن نیمی از DNA تک رشته‌ای است. در Tm 55-62، پرایمرها بهتر عمل میکنند.
محتوای GC پرایمر باید در 40-60% حفظ شود. محتوای 40-60٪= GC باعث پیوند پایدار پرایمرها برای اتصال توالی هدف آنها می‌شود. زیرا G-C دارای پیوند هیدروژنی سه گانه در مقایسه با جفت پایه A-T است که دارای پیوند هیدروژنی دوگانه است.
پرایمر در انتهای 3ˋ باید به G یا C ختم شود که به GC clap معروف است. پیوند هیدروژنی سه گانه ارتعاش را مجدداً استفاده می‌کند بنابراین فرصت بیشتری به پلیمراز می‌دهد تا پرایمر گسترش یابد.
پرایمر نباید بیش از سه نوکلئوتید G یا C در 5 نوکلئوتید آخر (3′) داشته باشد زیرا می تواند به طور غیر اختصاصی در برخی جاهای دیگر متصل شود (جفت شدن G-C پایدارتر از جفت شدن A-T است).
پرایمر نباید حاوی توالی‌های تکراری باشد زیرا می توانند باعث ایجاد ساختارهای ثانویه شوند و در نتیجه واکنش PCR را مهار کنند.
پرایمرهای فوروارد و معکوس نباید دارای توالی مکمل باشند. این میتواند به پرایمرهای تکثیر شده‌ای منجر شود که منجر به دایمر پرایمر می‌شود. دایمرهای پرایمر منابعی را که فرض می‌شود برای تکثیر DNA در دسترس هستند، جدا می‌کند.
برای برخی از توالی‌ها (پرموتورها، توالی‌های 5′ و 3′ UTR)، بدست آوردن پارامترهای پرایمر ایده آل مانند طول پرایمر، Tm و محتوای GC دشوار است زیرا توالی‌ها غنی از AT هستند. در این شرایط، باید Tm را در اولویت در نظر گرفت.

اگرچه شرایط ایده آل برای ساخت پرایمرها را ذکر کرده‌ایم، اما همیشه نمیتوان انتخاب توالی را کنترل کرد (به عنوان مثال تکثیر ژن از کدون آغاز). در این موارد، باید استراتژی طراحی پرایمر یا استراتژی تقویت را اصلاح کنید.

نمایش طراحی پرایمر فوق برای چند روش شبیه سازی مانند:

شبیه سازی TA
شبیه سازی بلاانت
شبیه سازی TOPO TA
شبیه‌سازی TOPO با انتهای بلانت

با این حال، روش‌های دیگر به توالی‌های اضافی نیاز دارند که به اتصال / ایجاد نوترکیب یا تعیین جهت‌پذیری کمک می‌کنند.

طراحی پرایمر برای شبیه سازی TOPO جهت دار (D-TOPO)

شبیه سازی D-TOPO یکی از ساده‌ترین اصلاحات را در بین روشهایی ارائه می‌دهد که به توالی‌های پرایمر اصلاح شده نیاز دارند. شبیه سازی D-TOPO امکان کلونینگ را در یک جهت خاص می‌دهد. این امر با امتداد کوتاهی از 4 نوکلئوتید ‘CACC’ که به انتهای 5′ پرایمر رو به جلو اضافه می‌شود به دست می‌آید. و هیچ تغییر خاصی در توالی (اضافه یا حذف) در پرایمر معکوس وجود ندارد. جدول زیر مقایسه پرایمرهای طراحی شده برای روشهای مختلف کلونینگ را نشان می‌دهد.

همچنین بخوانید:

مترجم : معصومه قریبی ششده

منبع

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه