دستگاه ها
دستگاه Real-Time PCR (ریل تایم پی سی آر) چیست؟
آزمایشگاه ژنیران دارای دستگاه Real-Time PCR مدل stepOne Plus از Thermo Fisher Scientific میباشد.
دستگاه real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) به جهت بررسی کمی مقادیر الگوهای اولیه در نمونه های DNA به هدف مثلا اندازه گیری طول تلومر و یا شمارش میتوکندری و یا نمونه های RNA با هدف سنجش بیان ژن موجودات زنده توسعه یافته است. علاوه بر این با دستگاه real-time PCR می توان به بررسی جهش ها و حذف و اضافه شدن های نوکلئوتیدی نیز پرداخت.
در حوزه کاربردهای مربوط به بررسی بیان ژن محدودیتی که سیستم PCR ساده بوجود آورده است عدم توانایی بررسی کمی میزان بیان یک ژن می باشد. لذا سیستمی تحت عنوان real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) ساخته شده و توسعه یافته است. آن چه که مشخص است هدف غایی ژن های موجودات زنده می باشد که کل مجموعه ژنومی تلاش در ساخت محصولاتی از جنس RNA و پروتئین دارد.
آن چه که می تواند مشخص کند یک سلول چه ویژگی هایی را در سطح فنوتیپی دارد و در چه سطحی آن ویژگی را بروز می دهد RNA یا ریبونوکلئیک اسید های آن سلول می باشد. همچنین جهت مقایسه دو سلول از نظر ویژگی های فنوتیپی نمی توان آن ها را در سطح DNA بررسی نمود، چرا که DNA همیشه ثابت بوده و یک ژن مشخص در بین موجودات یک گونه شباهت بسیاری به هم دارد و هیچ نشانه ای از میزان بیان آن ژن عرضه نمی کند.
لذا بررسی بیان یک ژن می تواند در سطح RNA و یا پروتئین انجام پذیرد. از طرفی بسیاری از ژن ها در نهایت به RNA تبدیل شده و نقششان را تحت عنوان RNA به انجام می رسانند. در نتیجه در برخی موارد محصول ژنی به شکل RNA عرضه شده و هیچ گاه قرار نیست به پروتئین ترجمه شودو بنابراین فقط RNA مورد بررسی قرار می گیرد.
مولکول RNA یا ریبونوکلئیک اسید به دلیل داشتن اکسیژن در کربن شماره 2 و همچنین تک رشته و کوتاه بودن آن، نسبت به مولکول های DNA واکنش پذیر تر بوده و تخریب پذیری بالایی دارد. در سیستم real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) جهت بررسی بیان یک ژن، ابتدا با کمک آنزیم نسخه بردار معکوس (Reverse Transcriptase) مولکول های RNA را به DNA های مکمل که عموما cDNA نامیده می شوند، تبدیل می کنند.
پس از پایداری مولکول مورد سنجش، وارد سیکل های real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) شده و بیان مورد بررسی قرار می گیرد. دستگاه real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) از یک سیستم اپتیکی بهره برده که توسط آن میزان DNA هر نمونه محاسبه می گردد. زمانی که cDNA سنتز شد، پس از آماده سازی نمونه جهت ورود به سیکل های پلیمریزه شدن، به نمونه DNA رنگی تحت عنوان سایبر گرین (SYBR Green) اضافه می گردد.
سایبر گرین (SYBR Green) موجب رنگ شدن DNA شده و همچنین خود دارای خاصیت فلورسنتی می باشد. زمانی که real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) سیکل های پلیمریزاسیون خود را شروع کرد، به ازای ساخته شدن رشته های DNA جدید، رنگ سایبر گرین (SYBR Green) به رشته متصل می شود و دستگاه real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) توسط سیستم اپتیکی خود خوانش فلورسنتی را شروع می کند.
لذا دستگاه real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) با خاصیت فلورسنتی سایبر گرین (SYBR Green) برای هر نمونه یک گراف تکثیر ترسیم می کند. هر نقطه از گراف تکثیر نشان دهنده میزان اتصال سایبر گرین (SYBR Green) به رشته DNA می باشد و در نهایت گراف که در نمایشگر متصل شده به real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) به نمایش در آمده، به آستانه خود می رسد.
گراف در دستگاه real-time PCR
این میزان نشان دهنده میزان DNA بیان شده در هر نمونه می باشد به این نحو که هر چه یک گراف تکثیر مرتبط با یک نمونه در سیکل های پایین تری از PCR به حد آستانه برسد میزان الگوی اولیه آن بیشتر بوده است و برعکس هر چه یک گراف دیرتر و در سیکل های بالاتر به حد آستانه برسد میزان الگوی اولیه آن کمتر بوده است.
بنابراین مقایساتی کمی نسبت به گزارشات کیفی از ارزش بالاتری برخوردار هستند، تکنیک real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) نیز نسبت به تکنیک هایی چون RT-PCR که میزان RNA تولید شده در سلول را به شکل کیفی گزارش می کند، از ارزش بالاتری برخوردار می باشد.
کالیبراسیون دقیق و به موقع برای عملکرد مناسب دستگاه real-time PCR بسیار مهم است.
Excitation/emission difference Corrections
عناصر نوری در دستگاه های real-time PCR می توانند به دو دسته اصلی تقسیم می شود: منبع تحریک excitation source ، مانند لامپ هالوژن یا LED و ردیاب انتشار emission detector ، مانند CCD یا Photodiode. در حالی که تولید کنندگان در صدد هستند تا یکنواختی عالی را برای حساسیت نسبت به طول موج تحریکی و طول موج ساطع شده به دست آورند با این حال همیشه درصدی خطا وجود خواهد داشت.
این تغییرات و خطاها ممکن است با افزایش سن و استفاده از ابزار افزایش یابد. اختلاف excitation/emission اصلاح نشده می تواند در مقادیر CT اختلال ایجاد کند. با برای حل این مشکل از یک رنگ مرجع غیر فعال در واکنش استفاده می کنند ،اساس این استفاده بر این واقعیت استوار است که اختلافات بر روی سیگنال های رنگ مرجع به همان اندازه بر روی سیگنال های رنگ گزارشگر تاثیر خواهد داشت بنابراین نرمال سازی سیگنال رنگ گزارشگر به مرجع می تواند این تفاوت را اصلاح می کند.
همچنین از علل دیگر که نیاز به رنگ رفرنس را توجیه می کند در ادامه آورده شده است. در تیوب ها و پلیت های پلاستیکی استفاده شده در real-time PCR ، مواد واکنش در پایین میکروتیوب ها و در نتیجه در انتهای چاهک ها قرار می گیرند،در نتیجه یک فضای هوا بالاتر از مایع وجود دارد و علاوه بر آن یک به اصطلاح مهر و موم پلاستیکی (در میکروتیوب) نیز روی مایع قرار می گیرد.
پلیت برای دستگاه real-time PCR
با این پیکربندی ، تعدادی از پدیده های مرتبط با دما رخ می دهد. در طول سیکل های حرارتی ، درجه حرارت به 95 درجه سانتیگراد می رسد. در آن درجه حرارت بالا ، آب در فضای هوا بالای تیوب ایجاد می شود. بخار آب بر روی دیواره های لوله متراکم شده و میعان شده و دوباره به واکنش بر می گردد. به این فرآیند “رفلاکس” می گویند، که در طول PCR مداوم است.
مورد سوم این که، فشار بخار به درب پلاستیکی تیوب نیرو وارد می کند و باعث می شود که در طی PCR کمی تغییر شکل دهد. همه این پدیده های مربوط به دما در مسیر تحریک و انتشار نور هستند و می توانند باعث نوسانات سیگنال فلورسنت شوند. درجه این نوسانات می تواند متفاوت باشد.به طور کلی، این نوسانات تغییرات بسیار زیادی در سیگنال گزارشگر ایجاد نمی کنند، اما بر دقت تکرار تأثیر می گذارند. با نر مال کردن سیگنال رنگ گزارشگر با رفع مرجع این نوسانات تصحیح می شوند.
آزمایشگاه ژنیران یکی از بهترین دستگاه های real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) را دارا بوده و توسط اساتید و کادر مجرب خود به آموزش کار با این دستگاه می پردازد. برای یادگیری انواع PCR و real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) به لینک بخش کارآموزی های ما مراجعه کنید:
کارآموزی ژنتیک مولکولی آزمایشگاه ژنیران
آشنایی با دستگاه های آزمایشگاهی
دقت و تکرار پذیری ریل تایم به چه عواملی وابسته است؟
با تکرار گذاشتن و به دست آوردن Efficiency آزمایش
سلام شما کالیبراسیون pcr انجام میدین؟
سلام، متاسفانه خیر
دوره ریل تایم کارشناسی دستگاه چقدره مدت و هزینه اش؟
متشکرم
کار با ریل تایم را میتوانید در دوره ژنتیک مولکولی یا در کارگاه ریل تایم آموزش ببینید. جزئیات هر کدام را میتوانید از منو در بخش دوره های آموزشی یا کارگاه ها مشاهده کنید
سلام خسته نباشید دستگاه real time pcr موجود هست واگر هست قیمتش چنده؟؟
سلام دوست عزیز لطفا جهت اطلاعات بیشتر با ازمایشگاه تماس بگیرید.
سلام.وقت بخیر
چطور می تونم از کلاس های آنلاین شما برای بیوانفورماتیک و ماشین لرنینگ استفاده کنم
با ازمایشگاه جهت ثبت نام تماس بگیرید یا از طریق لینک زیر اقدام فرمایید:
https://www.geniranlab.ir/18-%d8%b1%d8%a7%d9%87%d9%86%d9%85%d8%a7%db%8c-%d8%ab%d8%a8%d8%aa-%d9%86%d8%a7%d9%85-%d8%af%d8%b1-%d8%b3%d8%a7%db%8c%d8%aa-%d8%a2%d8%b2%d9%85%d8%a7%db%8c%d8%b4%da%af%d8%a7%d9%87-%da%98%d9%86%db%8c
سلام وقت بخیر . من از وقتی با سایت شما اشنا شدم خیلی مطالب مفیدی یاد گرفتم ،میخواستم بدونم شماکلاس های آنلاین برای افراد خارج از ایران هم برگزار میکنید؟
سلام دوست عزیز بله ما کلاس های آنلاین هم داریم ولی ریل تایم انلاین نیست. دوره های بیوآرت ،دوره های ماشین لرنینگ و آر ، بیوانفورماتیک و سیستم بیلوژی انلاین هستند.
مفید و ساده بود.
کنترل مثبت منفی نداره؟
با سلام آزمایشی که در ویدیو مشاهده کردین بخشی از یک کار تحقیقاتی بود که میزان بیان ژن ها در آن سنجیده شده است
بنابراین نمونه ای به عنوان کنترل مثبت نداره
ولی برای چک آلودگی به عنوان کنترل منفی در یک نمونه تنها مسترمیکس PCR بدون نمونه لود شده است.
فوق العاده بود استفاده کردم .ممنون از شما و خسته نباشید.
سلام وقت بخیر کارآموزی در آزمایشگاه شما به چه صورت است؟
عالی بود
سلام
ممنون از توصیحات خوب و مفیدتان
محمدی
عالي بود.ممنون
خیلی عالی و کاربردی بود ممنون
خسته نباشید
خیلی ممنون بخاطر توضیحات جامع و ویدئویی که ساخته بودید
بسیار مفید بود