سنجش لوسیفراز

سنجش لوسیفراز :

گزارش های ژنتیکی که در زیست شناسی سلولی استفاده می شود به طور معمول بیان ژن و رویداد های همراه با بیان ژن مانند فعالیت گیرنده ها، انتقال سیگنال های درون سلولی، پردازش mRNA، فولدینگ پروتئین و برهم کنش پروتئین-پروتئین را نشان می دهد.

 

لوسیفراز کرم شبتاب (firefly) به عنوان یک گزارشگر به دلایل زیر به طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد:

۱- فعالیت این گزارشگر بلافاصله پس از ترجمه در دسترس است زیرا پروتئین نیاز به تغییرات پس از ترجمه ندارد.

۲-این آزمایش بسیار حساس است چرا که نور تولید شده آن دارای بالاترین بازده کوانتومی بوده که برای هر واکنش شیمیایی مولکولی شناخته شده است و همچنین هیچ نور پس زمینه ای در آزمایش های مختلف یافت نمی شود که نشان دهنده قدرت تفکیک بالاست.

لوسیفراز کرم شب تاب

۳-این آزمایش سریع بوده و برای هر نمونه تنها چند ثانیه زمان نیاز دارد.

سیستم تست لوسیفراز به طور قابل ملاحظه ای نسبت به روش های متداول پیشین هم در زمینه حساسیت و هم در سادگی کار بهبود یافته است.

در این سیستم با تبدیل انرژی شیمیایی اکسیداسیون لوسیفرین از طریق گذار الکترون، نور تولید می شود. لوسیفراز کرم شبتاب که یک پروتئین مونومر ۶۱ کیلودالتونی است، اکسیداسیون لوسیفرین را با استفاده از ATP  و منیزیم (به عنوان کمک سوبسترا) کاتالیز می کند. در آزمایش های متداول لوسیفراز، تابش نور به سرعت پس از ترکیب آنزیم و سوبسترا شروع می شود.

سیستم تست لوسیفراز شامل کوآنزیم  Aاست که باعث فعالیت بیشتر آنزیم می شود و در نتیجه افزایش شدت نور را به همراه دارد که می تواند برای حداقل ۱ دقیقه ثابت باشد.

سیستم تست لوسیفراز نتایج را به صورت خطی در حداقل هشت برابر شدت بدست آمده نشان می دهد که در شرایط مطلوب مقدار پیکو مول از آن قابل شناسایی است. به طور کلی می توان گفت این تست که برای اندازگیری میزان گزارش های مختلف در سلول های پستانداران ایجاد شده تا  صد برابر حساس تر از تست Acetyltransferase (CAT) Chloramphenicol  است.

لوسیفراز

 

References

Friedl P, Alexander S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 2011 Nov 23;147(5):992-1009.
Zena Werb et. Al. Extracellular Matrix Degradation and Remodeling in Development and Disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Dec; 3(12): a005058.
Chen HC. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 2005;294:15-22.
Guan JL. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2007;2(2):329-33.