جداسازی نوتروفیل های انسانی

نوتروفیل

جداسازی نوتروفیل های انسانی

نوتروفیل های چند هسته ای انسان (PMN) فراوان ترین سلول هسته دار در خون در حال گردش است. PMN دارای گرانولهای مشخصه سیتوپلاسمی حاوی پلی پپتیدهای ضد میکروبی است و می تواند گونه های اکسیژن فعال ضد میکروبی تولید کند. چرخه زندگی PMN شامل بلوغ و آزاد شدن از مغز استخوان ، گردش خون ، پایبندی سست به اندوتلیای عروقی و پاکسازی PMN پیری توسط سیستم رتیکولواندوتلیال است. در صورت فعال شدن ، PMN محیطی به اندوتلیای عروقی می چسبد و از عروق خارج می شود و در جهت محرک های عفونی یا التهابی حرکت می کند ، فرایندی که رفتار آنها را به طور قابل توجهی تغییر می دهد. با برخورد با میکروب ها ، PMN ممکن است تله های خارج سلولی نوتروفیل (NET) ایجاد کند ، محتوای گرانول آنها را آزاد کند ، واسطه های التهابی تولید کند ، گونه های واکنش اکسیژن (ROS) تولید کند و میکروب ها را از طریق فاگوسیتوز غرق کند. پس از فعال شدن ، PMN می تواند به عنوان یک واکنش التهابی در حال تکامل سهیم باشد و یا تحت آپوپتوز قرار گیرد که با فاگوسیتوز PMN توسط ماکروفاژهای بافتی به اوج خود می رسد.

با توجه به عمر نسبتاً کوتاه PMN در محیط کشت ، شروع آزمایش بدون تأخیر پس از جدا شدن از خون ، ضروری است. با این وجود ، PMN پس از جمع آوری حداکثر تا 24 تا 48 ساعت می تواند در خون ضد انعقاد زنده بماند و در نتیجه اجازه انتقال خون بیمار از طریق پیک شبانه را می دهد. در صورت حمل نمونه های بیمار ، حمل نمونه های اهدا کننده سالم برای محاسبه اثرات حمل و نقل و تأخیر در پردازش روی نقاط نهایی بیولوژیکی ضروری است.

PMN کاملاً حساس به آلودگی های رایج است. تمام محیط ها و موادی که با خون یا سلول ها تماس می گیرند باید فاقد پیروژن باشند. در مواردی که مشخص نشده باشد ، خون و سلولها را در PH فیزیولوژیک ، دمای اتاق و در صورت عدم وجود کاتیونهای دو ظرفیتی حفظ کنید تا بتواند باعث محدود شدن فعال سازی شود. برای کاهش فعال سازی PMN ناشی از چسبندگی ، لوله های پلی پروپیلن فاقد پیروژن توصیه می شود. از پیپتهای بدون پیروژن و نوک پیپتها (ترجیحاً با موانع آئروسل) باید استفاده شود. استفاده از یک کابینت ایمنی زیستی با هوای فیلتر شده HEPA ممکن است احتمال فعال شدن سلول را بیشتر کاهش دهد.

پروتکل جداسازی نوتروفیل ها با استفاده از شیب تراکم مبتنی بر Percoll

جداسازی PMN خون محیطی انسان شامل حذف گلبول های قرمز خون (RBC) با استفاده از دکستران و لیز هیپوتونیک RBC باقیمانده است.PMN  از PBMC با استفاده از شیب های تراکم یا جداسازی مبتنی بر Percoll که در این پروتکل شرح داده شده یا Ficoll-Paque premium به عنوان یک شیب چگالی (پروتکل جایگزین) جدا می شود.

  1. لوله های خون گیری را با سرعت 400 g به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
  2. پلاسما (فاز فوقانی) را به لوله فالکون 15 میلی لیتری جدید منتقل کرده و دوباره سانتریفیوژ کنید تا تمام لکوسیت ها از پلاسما جمع شوند.
  3. پلت غنی را به لوله جدید انتقال دهید و به مدت 10 دقیقه در ≥ 2000 g سانتریفیوژ کنید تا پلاکت خارج شود.
  4. لایه حاوی RBC را از لوله های خون گیری  به درون لوله فالکون 50 میلی لیتری انتقال دهید  سپس خون را با چند میلی لیتر HBSS (-) به حجم برسانید تا بازده کار افزایش یابد و بعد آن به لوله 50 میلی لیتری منتقل شود.
  5. 5.     25 میلی لیتر 3٪ دکستران اضافه کرده و 5 بار آن را وارونه کنید تا مخلوط شود. اجازه دهید به مدت 20-40 دقیقه رسوب کند.
  6. مایع اضافی حاوی لکوسیت ها را درون یک لوله مخروطی مخلوط 50 میلی لیتری تازه پیپت کنید. تا آنجا که ممکن است لایه RBC رسوب شده را پشت سر بگذارید.
  7. سانتریفیوژ در 500  g 10 دقیقه
  8. حل کردن پلت در بافر سالین 0.9 درصد
  9. اضافه کردن محلول بدست آمده به محلول فایکول
  10. سانتریفیوژ در 500 g به مدت 40 دقیقه
  11. جدا کردن لایه سفید میانی و انتقال آن به فالکون جدید
  12. لیز کردن RBC ها با بافر سالین 1.8 درصد
  13. سانتریفیوژ سپس شست و شوی پلت تا شفاف شدن مایع رویی

برای مطالعه سایر تکنیک آزمایشگاهی کلیک کنید.

برای مشاهده و ثبت نام دوره کارآموزی کشت سلولی اینجا کلیک کنید

برای سفارش خدمات به آزمایشگاه کشت سلول ژنیران اینجا کلیک کنید