ویدیو های آموزشی آزمایشگاه

آموزش بیسیک پی سی آر -Basic PCR

PCR basic

PCR و یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز عبارت است از سیکل های تکرار شونده از گرم کردن و سرد کردن نمونه حاوی DNA که به جهت ساختن کپی های زیادی از یک منطقه مشخص شده در DNA انجام می گردد.

عموما PCR basic در سه stage انجام می پذیرد.

در stage 1 ابتدا دما تا نزدیکی دمای جوشیدن آب بالا رفته و موجب شکستن پیوند های هیدروژنی بین دو رشته DNA شده و دو رشته از هم جدا می شوند. این مرحله تقریبا به مدت 5 دقیقه انجام می پذیرد و هدف از آن اطمینان از باز شدن همه رشته ها قبل از ورود به stage2 می باشد. نام این مرحله denaturing می باشد.

سپس PCR وارد stage 2 شده که شامل سه مرحله به شکل سیکل های تکرار شونده می باشد.

همانطور که گفته شد در basic PCR ابتدا سیکل اول که denaturing نامیده می شود، دما تا نزدیکی دمای جوشیدن آب بالا رفته و موجب شکستن پیوند های هیدروژنی بین دو رشته DNA شده و دو رشته از هم جدا می شوند. زمان این مرحله کمتر بوده و در حدود 40 ثانیه می باشد.

سپس با کاهش دما توالی های کوچک DNA که به عنوان پرایمر شناخته می شوند، به نواحی ای از DNA که از نظر توالی باهم مکمل هستند، متصل می شوند. این مرحله annealing نامیده می شود. زمان این مرحله در حدود 40 ثانیه می باشد.

اتصال پرایمر به نواحی خاص در DNA، موجب نشان دار شدن آن ناحیه برای کپی شدن می گردد.

با افزایش دوباره دما تا نزدیکی 72 درجه سانتی گراد، آنزیم taq polymerase که به شکل آبی دیده می شود، به نواحی پرایمری متصل شده و یکی یکی نوکلئوتید ها را برای ساخت رشته دوم اضافه می کند. نام این مرحله extending بوده و به مدت 40 ثانیه انجام می گیرد.

در ادامه برای ساخته شدن کپی های بیشتری از DNA سیکل basic PCR که شامل مراحل denaturing، annealing و extending می باشد، چندین بار تکرار می شوند.

پس از گذشتن سه سیکل از basic PCR ، توالی مورد هدف، که توسط پرایمر شناسایی می شود، به شکل اختصاصی ساخته می شود.

بعد از گذشت 30 سیکل، میلیون ها کپی از نسخه اولیه DNA ساخته شده است و stage 2 به اتمام رسیده است.

در نهایت stage 3 با هدف طویل سازی نهایی در دمای 72 درجه انجام می پذیرد. هدف این مرحله اطمینان از تکمیل شدن رشته هایی هستند که در مرحله سوم، stage 2 کامل نشده اند. بدین معنی که آنزیم فرصت تکمیل ساخت رشته جدید را نداشته و آن را نیمه کاره رها کرده است.

نام این مرحله Final Extention می باشد و زمان آن در حدود 10 دقیقه می باشد.


نظرات شما

avatar

این سایت از اکیسمت برای کاهش هرزنامه استفاده می کند. بیاموزید که چگونه اطلاعات دیدگاه های شما پردازش می‌شوند.

  عضویت  
مطلع کردن