ژل الکتروفورز میدان پالسی (PFGE) چیست؟
ژل الکتروفورز میدان پالسی (PFGE) یک تکنیک تایپ مولکولی قدرتمند است که توسط آن DNA ژنومی (Genomic DNA) از ارگانیسم مورد نظر جدا میشود و به دنبال آن آنالیز آنزیم محدود کننده صورت میپذیرد. سپس فرآوردههای هضم روی یک ژل آگارز (Agarose gel) با اعمال یک میدان الکتریکی که به طور دورهای جهت را تغییر داده و امکان جداسازی قطعات DNA بزرگتر (کل DNA ژنومی) و اندازهگیری تقریبی طول قطعه را میدهد، آنالیز میشوند.
PFGE میتواند مولکولهای DNA بزرگ (تا 10 مگا باز) را جدا کند، در حالی که ژل الکتروفورز DNA استاندارد معمولاً قطعات تا 50 کیلو بازی را تجزیه میکند. PFGE حدود 2 تا 3 روز (جدا از آمادهسازی نمونه) طول میکشد.
PFGE اولین بار توسط Schwartz و همکارانش در مخمر توسعه داده شد. بزرگترین مولکولی که تاکنون توسط ژل الکتروفورز میدان پالسی تفکیک شده، 14 مگا باز تخمین زده شده است (Barry و Pollard، 1993).
PFGE نوعی ژل الکتروفورز آگارز است. برخی از تفاوتهای عمده بین ژل الکتروفورز معمولی و PFGE در جدول زیر آورده شده است:
| ویژگی | ژل الکتروفورز معمولی | ژل الکتروفورز میدان پالسی |
| قدرت تفکیک (قدرت تفکیک کننده) | قطعات DNA تا حدود 50 کیلو باز را جدا میکند. | میتواند مولکولهای DNA بزرگ (تا 10 مگا باز) را جدا کند. |
| جهت جریان | جریان فقط در یک جهت اجرا میشود. | جهت جریان از الکترودهای اولیه به الکترودهای ثانویه که در زاویه 60 درجهای از مرکز ژل آگارز قرار دارند، تغییر میکند. |
مراحل ژل الکتروفورز میدان پالسی
آمادهسازی سلولهای باکتریایی
- ایزولههای باکتری (مانند استافیلوکوکوس اورئوس (Staphylococcus aureus)) را روی پلیتهای TSA قرار دهید و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 تا 24 ساعت انکوبه کنید.
- سلولهای باکتریایی را با آگارز ذوب شده مخلوط کرده و در بطری حاوی کپک بریزید.
- سلولهای باکتریایی در ژل آگارز قرار میگیرند تا از برش DNA کروموزومی جلوگیری شود و هضم DNA در محل انجام شود.
لیز (Lysis) سلولهای باکتریایی
سلولهای باکتریایی با مواد بیوشیمیایی شکسته شده یا لیز میشوند، به طوری که DNA در ظرفهای حاوی آگارز آزاد میشوند. کروموزوم باکتریایی با استفاده از یک آنزیم برش کمیاب که توالیهای DNA خاصی از 6 تا 8 نوکلئوتید (Nucleotide) را تشخیص میدهد، هضم میشود و در نتیجه تعداد محدودی قطعات DNA با طولهای مختلف ایجاد میکند. پس از محدود کردن DNA، برشهایی از بلوکهای آگارز در چاهکهای ماتریکس ژل آگارز وارد میشوند.
الکتروفورز
نمونههای DNA هضم شده در ظرف ژلاتین DNA در یک ژل قرار داده میشوند و با تناوب میدان الکتریکی بین جفتهای الکترود مجزای چند جانبه، در معرض جداسازی قرار میگیرند.
استفاده از یک میدان الکتریکی که به طور دورهای در حال تغییر جهت میباشد باعث میشود مولکولهای DNA طولانی در طول الکتروفورز جهت گیری مجدد کنند.
زمان مورد نیاز برای تغییر جهت نیز با اندازه قطعه DNA نسبت معکوس دارد. از آنجایی که مولکولهای کوچکتر سریعتر از مولکولهای بزرگتر جهتگیری میکنند، اگر ژل برای مدت زمان کافی اجرا شود، اندازههای مختلف قطعات DNA از کیلوباز تا مگاباز جدا میشوند. این فرآیند یک پروفایل اثر انگشت DNA (DNA Fingerprint profile) ایجاد میکند که میتوان آن را به صورت دیجیتالی تصویر برداری کرد.
این سیستم از 24 الکترود در یک آرایش هشت ضلعی تشکیل شده است و یک گرادیان الکتروفورز ثابت ایجاد نموده که از الکترودهای اولیه به الکترودهای ثانویه که در زاویه 60 درجه از مرکز ژل آگارز قرار دارند سوییچ میکند. در نتیجه، این پیکربندی باعث میشود که مولکولهای DNA در ماتریکس ژل آگارز با زاویه 120 درجه تغییر جهت دهند.
رنگآمیزی ژل
ژل رنگآمیزی میشود تا DNA زیر نور فرابنفش (UV) قابل مشاهده باشد.
عکاسی و پردازش تصویر
یک دوربین دیجیتال از ژل عکس میگیرد و تصویر را در کامپیوتر ذخیره میکند. تصاویر ژل به دست آمده نرمالسازی میشوند و الگوهای قطعات DNA با استفاده از نرمافزارهای مختلف مانند BioNumerics (Applied Maths, Austin, TX, USA)، Fingerprinting II (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)، GelQuest (SequentiX, Klein, Raden, Germany) و PyElph (Pavel & Vasile, 2012) آنالیز میشوند. این نرمافزارها و نرمافزارهای مشابه دیگر به ذخیرهسازی، به اشتراک گذاری و آنالیز دادههای PFGE کمک میکنند.
همچنین بخوانید:
- الکتروفورز کپیلاری (Capillary Electrophoresis): اصول، کاربرد، مزایا و معایب
- الکتروفورز مویرگی چیست؟
- الکتروفورز افقی-ژل آگارز
- الکتروفورز عمودی- اکریل آمید
- 37 مورد از انواع PCR به همراه تعریف، اصول و کاربرد
مترجم: صادق حسینیکیا
