دوره آموزشی بیوانفورماتیک

طراحی پرایمر یکی از مباحث فوق العاده با اهمیت در مباحث مولکولی می باشد. چرا که تا حد زیادی موفقیقت تکنیک PCR و Real-Time PCR در گرو طراحی پرایمر مناسب می باشد. طراحی پرایمر نامناسب می تواند منجر به عدم تکثیر قطعه مورد نظر در PCR، تولید کم محصول PCR و یا از سوی دیگر منجر به تولید غیر اختصاصی محصولات PCR می گردد. لذا در طراحی پرایمر بایستی دقت کافی اعمال شود. برای طراحی پرایمر ابتدا بایستی توالی ژن مورد مطالعه را به فرمت FASTA از بانک های توالی اسیدنوکلئیک بدست آورد. یکی از معروف ترین بانک های توالی نوکلئوتیدی سایت NCBI می باشد. در مرحله ی بعدی از راه های مختلفی می توان اقدام به طراحی پرایمر نمود. یکی از نرم افزار های کاربردی به منظور طراحی پرایمر، نرم افزار gene runner می باشد. در طراحی پرایمر بایستی به یکسری پارامترهایی از جمله طول پرایمر، درصد GC، ساختارهای runs، دمای Tm و دمای annealing، عدم وجود ساختارهای ثانویه مانند دایمر پرایمر، GC clamp و اختصاصی بودن پرایمر طراحی شده، توجه نمود. در اینجا به اختصار به آموزش طراحی پرایمر به زبان ساده می پردازیم.

طراحی پرایمر
طراحی پرایمر

طول پرایمر بایستی بین 18 تا 24 نوکلئوتید در نظر گرفته شود. پرایمرهای با طول کمتر از 18 نوکلئوتید به دلیل احتمال شباهت زیاد به مکان های متعددی از ژنوم متصل شده و در نتیجه منجر به تولید محصولات غیر اختصاصی در PCR می گردد.

در مورد پارامتر درصد GC، بهترین محدوده ی توصیه شده بین 40 تا 60 می باشد. اختلاف درصد GC بین پرایمرهای رفت و برگشت نبایستی بیشتر از 5 درصد باشد.

در مورد معیار دمای Tm، بهترین محدوه ی توصیه شده بین 50 تا 60 درجه می باشد. اختلاف دمای Tm بین پرایمرهای رفت و برگشت توصیه می شود بیشتر از 2 درجه نباشد.

در طراحی پرایمر بایستی از وجود ساختار های runs( توالی های تکراری پشت سر هم) و وجود ساختارهای ثانویه مانند ساختار های ساقه-حلقه (stem loop)، ساختار های سنجاق سری (hairpin) و ساختارهای دایمر پرایمر اجتناب نماییم.

از آنجایی که سر ‘3 پرایمر از اهمیت خاصی در تکثیر قطعه ی مورد مطالعه برخوردار است بایستی از اتصال مناسب آن اطمینان حاصل نماییم که بهتر است پرایمر در سر ‘3 خود دارای C و یا G باشد.

اتصال اختصاصی پرایمر را می توان از طریق سایت Primer Blast آنالیز نمود.