به منظور ارزیابی میزان بیان ژن‎ها، لازم است ابتدا RNA های یک سلول استخراج شود تا از روی آن‌ها به کمک آنزیم Reverse Transcriptase یک مولکول DNA مکمل یا همان (Complementary DNA) که موسوم به cDNA است، ساخته شود. آنزیم Reverse Transcriptase نوعی پلیمراز وابسته به RNA است که همانند تمام پلیمراز های دیگر برای ساخت DNA علاوه بر dNTP ها به یک پرایمر کوتاه نیاز دارد. پس از ساخت cDNA امکان آنالیز کمی میزان بیان ژن مربوطه توسط واکنش های Real-Time PCR فراهم می‌گردد.

در سنتز cDNA از سه نوع پرایمر می توان استفاده کرد: Oligo(dt)، Random hexamer و اختصاصی

از پرایمر Oligo(dt) جهت سنتز cDNA از روی mRNA استفاده می شود. این پرایمر به دلیل داشتن توالی غنی از نوکلئوتید تیمین و در نتیجه مکمل بودن با انتهای رشته‏ی mRNA، به دم پلی A انتهای mRNA متصل می شود.

از پرایمر Random hexamer جهت سنتز cDNA از روی mRNA و دیگر RNA های استخراج شده استفاده می‎شود. این پرایمر به صورت توالی های ۶ نوکلئوتیدی تصادفی طراحی شده که به صورت تصادفی به نقاط مختلف RNA متصل می شود.

جهت سنتز cDNA برای دیگر RNAها مانند microRNA از پرایمرهای اختصاصی مانند stem-loop استفاده می‎شود. به دلیل قابلیت ایجاد یک ساختار سنجاق سری یا hairpin باعث اتصال و شناسایی اختصاصی microRNA ها می‎شود.

روش کار:

نمونه های RNA آماده شده و داخل تیوب ریخته می شوند و بر اساس نام نمونه ها لیبل می گردند. باید دقت شود آبی که RNA حل شده است فاقد RNAase باشد. مقدار مناسب از پرایمر به هر تیوب اضافه می شود. نمونه ها اسپین شده و به دستگاه ترمال سایکلر منتقل می گردند. دستگاه روی ۶۵ درجه سانتی گراد تنظیم شده و نمونه ها به مدت ۵ دقیقه درون ترمال سایکلر انکوبه می شوند. اینکار جهت از بین بردن ساختار ثانویه RNA شده و رشته را کامل باز می کند. پس از اتمام انکوباسیون نمونه ها بر روی یخ به مدت یک دقیقه قرار داده می شوند. در ادامه به هر نمونه، مقدار مناسب مسترمیکس اضافه شده و اسپین میگردند. در نهایت نمونه ها با سرعت به دستگاه ترمال سایکلر منتقل گردیده و برنامه Geneall بر روی دستگاه اجرا می شود. در برنامه Geneall نمونه به ترتیب در سه دمای مختلف قرار می گیرد. دمای اول که ۵۵ درجه سانتی گراد است، جهت اتصال پرایمر، سپس اتصال آنزیم و سنتز cDNA می باشد. دمای دوم که ۸۵ درجه سانتی گراد است، جهت غیر فعال کردن آنزیم بوده و دمای سوم جهت خنک کردن نمونه می باشد. پس از اتمام واکنش، نمونه ها به فریز منفی ۲۰ درجه سانتی گراد متقل شده و در آنجا نگهداری می شوند.