سنجش غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک

سنجش غلظت و خلوص اسیدهای نوکلئیک

زمانی که فرد توانست اسید نوکلئیک مورد نظر خود را استخراج کند باید غلظت آن ها را مورد سنجش قرار دهد تا از کمیت و کیفیت کار خود مطلع شود. ترکیبات کروموفور ترکیباتی هستند که در طول موج های مشخص رفتار های خاصی از خود نشان می دهند. ترکیبات کروموفور عموما بخشی از مولکول هستند که ساختار حلقوی داشته و بخشی از نور را جذب کرده و بخش دیگر را از خود عبور می دهند. بخش جذب شده موجب تهییج و برانگیختگی الکترون ها از سطوح پایه خود به سطوح بالاتر شده و در نهایت با بازگشت الکترون به سطوح پایه خود، انرژی آن به شکل نور ساطع می شود. مسئله ای که مسلم است؛ هرچقدر میزان یک کروموفور بیشتر باشد، میزان جذب آن بیشتر خواهد شد. این اصل امروزه به یکی از روش های سنجش غلظت ترکیبات کروموفور مبدل شده است. اسید های نوکلئیک به دلیل حضور باز های آلی حلقوی که مولکول کروموفور اسید های نوکلئیک می باشند، در محدوده موج الکترومغناطیسی ۲۶۰ نانومتر بالاترین جذب نوری را دارد. داشتن خاصیت جذب نوری در اسید های نوکلئیک موجب شده تا این روش به یکی از بهترین و کم هزینه ترین روش های غلظت سنجی اسید های نوکلئیک مبدل شود. مسئله ای که مبرهن است استخراج اسید های نوکلئیک همیشه از سلول انجام شده و یک سلول مملوء از ترکیبات زیستی می باشد. این ترکیبات شامل انواع پروتئین ها، کربوهیدرات ها و لیپید ها می باشد. در پروسه های مختلف استخراج اسید های نوکلئیک، جداسازی کربوهیدرات ها و لیپید ها از محلول عصاره سلولی، به آسانی انجام شده و جداسازی پروتیئن کمی دشوار تر است. لذا همیشه آلودگی پروتئینی ممکن است در استخراج وجود داشته باشد. همچنین ترکیباتی مانند فنل در پروسه استخراج به کار رفته و ممکن است به خوبی از اسید های نوکلئیک جدا نشده و موجب آلودگی شود. بسته به اسید نوکلئیک مورد نیاز جهت استخراج، DNA باشد یا RNA، پروسه استخراج فرق خواهد داشت. قابلیت مهم و مورد اهمیت که غلظت سنجی با جذب نوری فراهم می آورد، امکان سنجش میزان آلودگی های مختلف با مولکول های کروموفور، در ترکیب مورد نظر می باشد. به عنوان مثال پروتئین ها در طول موج ۲۸۰ نانومتر و فنل در محدوده طول موج ۲۳۰ نانومتر بیشترین جذب را دارد و با بررسی نمونه ای که به عنوان استوک اسید نوکلئیک استخراج شده در نظر گرفته می شود، می توان میزان آلودگی آن را نیز مشخص نمود.

روش بررسی جذب نوری یک ترکیب، تکنیک اسپکتروفوتومتری نامیده می شود. همچنین دستگاهی که میزان جذب نوری ترکیبات را می سنجد اسپکتروفوتومتر نامیده می شود. طبق قانون وضع شده توسط بیر و لامبرت، میزان جذب نوری با غلظت یک ترکیب کروموفور رابطه مستقیم دارد. رابطه ای که بیر و لامبرت تعیین کردند و طبق آن قانون بیر-لامبرت را وضع کردند، که این قانون اشاره دارد لگاریتم در مبنای ۱۰ نسبت نور اولیه نسبت به نور عبور کرده از محلول برابر با حاصلضرب ضریب جذب نوری در ضخامت نمونه در غلظت نمونه می باشد. به عبارتی اگر ضریب جذب نوری هر ترکیبی را در دست داشته باشیم، با بررسی جذب آن می توانیم میزان غلظت آن را به دست بیاوریم. همچنین در رابطه با اسید های نوکلئیک که در طول موج ۲۶۰ نانومتر بیشترین جذب را دارند، می توان با بررسی جذب نوری در طول موج های مربوط به آلودگی های دیگر و نسبت گیری آن ها، میزان آلودگی را به دست آورد.

دستگاه های اسپکتروفوتومتر در انواع مختلف ساخته شده اند. برخی از این دستگاه ها تک چاهکی و برخی چند چاهکی هستند. یکی از بزرگترین ایراداتی که دستگاه های اسپکتروفوتمتر قدیمی داشتند، نیاز به نمونه در حجم بالا و همچنین عدم توانایی سنجش جذب نوری نمونه در چند طول موج به طور همزمان بود. امروزه دستگاه هایی تحت عنوان نانودراپ اسپکتروفوتومتر ساخته و گسترش پیدا کرده اند که به نمونه در مقادیر بسیار کم احتیاج داشته و توانایی سنجش چندین نمونه به طور همزمان را دارا هستند. دستگاه نانودراپ به کامپیوتر متصل بوده و فقط با تعریف کردن نوع نمونه که به عنوان مثال از نوع اسید های نوکلئیک است، انواع سنجش ها در طول موج های مختلف را انجام داده و علاوه بر محاسبه خودکار میزان غلطت ترکیب مورد نظر، آلودگی های آن را در قالب یک فایل گزارش می دهد.