آشنایی با روش های الکتروفورز محصول PCR

الکتروفورز محصول PCR

زمانی که پروسه PCR به اتمام رسید، محصولات درون ویال های مختلف حاوی اسیدهای نوکلئیک تکثیر شده می باشند. مهم ترین مرحله هر PCR بخش Post PCR یا همان الکتروفورز با ژل می باشد؛ چرا که نشان دهنده نتایج حاصل از PCR خواهد بود. الکتروفورز در نهایت نشان خواهد داد که کیفیت PCR انجام شده به چه شکل است. عموماً هدف از الکتروفورز بیومولکول ها جدا سازی آن ها بر اساس وزن مولکولی و برخی اوقات بر اساس بار می باشد که در اثر این جداسازی هریک از بیومولکول های با وزن یکسان به شکل باند در ژل الکتروفورز نمایان می شوند.

اساس الکتروفورز حرکت بیومولکول ها بر اساس بارشان درون خلل و فرج ژل می باشد. ژل یک بستر منفذ دار را تشکیل می دهد که اسید های نوکلئیک و پروتئین ها می توانند درون آن منافذ حرکت کنند. درصد ژل رابطه عکس با منافذ خود دارد، لذا هرچقدر ژل غلیظ تر و درصد بالاتری داشته باشد منافذ کوچک تری خواهد داشت. در سیستم الکتروفورز بر اساس بار مولکولی یک بیومولکول، چاهک هایی در یک سمت ژل ایجاد می شود و نمونه های مورد الکتروفورز درون آن وارد می شود. ژل الکتروفورز درون تانک الکتروفورز که از بافر مخصوص پر شده، قرار گرفته و تحت تأثیر جریان الکتریکی قرار می گیرد. تانک الکتروفورز در یک سمت قطب مثبت (آند) و در سمت دیگر قطب منفی (کاتد) دارد، که هر کدام از آن ها با توجه به مثبت و منفی بودن به منبع تغذیه متصل می شود. اگر که نمونه ما بار منفی داشته باشد چاهک ها در سمت قطب منفی و اگر نمونه بار مثبت داشته باشد چاهک ها در سمت قطب مثبت قرار می گیرند.

اسید های نوکلئیک به دلیل وجود گروه های فسفات در Back Bone خود، بار منفی داشته و به عنوان آنیون همیشه می توانند از سمت قطب کاتد به سمت آند حرکت کنند. لذا چاهک های ژل در الکتروفورز اسید های نوکلئیک همیشه در سمت قطب کاتد قرار می گیرد. اسید های نوکلئیک کوچکتر با سرعت بالاتر و آن هایی که بزرگ تر هستند با سرعت کمتر حرکت می کنند. لذا پس از الکتروفورز چند نمونه DNA در زمان مشخص، براساس حرکت و قرارگیری آن ها می توان به اندازه اشان پی برد. همچنین هرچقدر غلظت نمونه بیشتر باشد باند تشکیل شده پهنای بیشتری خواهد داشت. عموماً در الکتروفورز یکی از چاهک ها اختصاص با نمونه Ladder می باشد. نمونه Ladder حاوی ترکیباتی از جنس نمونه ای که قرار است الکتروفورز شود، می باشد که در وزن های مختلف تهیه شده است. با لود کردن نمونه Ladder در یکی از چاهک ها، ما تعدادی باند در راستای چاهک Ladder خواهی داشت که مانند یک خط کش عمل کرده و هر کدام وزن مولکولی مشخصی دارد. لذا با تطبیق نمونه های مجهول با باند های Ladder، می توان وزن تقریبی نمونه مجهول را حدس زد.

اسید های نوکلئیک به دو روش افقی و عمودی الکتروفورز می شوند. عموما از ژل آگارز برای الکتروفورز افقی و ژل پلی آکریل آمید برای الکتروفورز عمودی استفاده می شود. در دوره‌ی کارآموزی ژنتیک مولکولی آزمایشگاه ژنیران الکتروفورز افقی با ژل آگارز و الکتروفورز عمودی با ژل پلی آکریل آمید به دفعات تکرار شده و دانشجویان با این دو تکنیک به خوبی آشنا می شوند