مقدمهای بر اسکنر میکرواری
میکرواری ابزاری است که به تشخیص بیان هزاران ژن (Gene expression) به طور همزمان کمک میکند. این میکرواری تراشههای ژنی یا تراشههای DNA (دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (Deoxyribonucleic acid)) نامیده میشود، زیرا لام مربوط به آن از محلهای (Spot) کوچکی برای جاسازی DNA به مانند یک ریزتراشه، تشکیل شده است. مولکولهای DNA در هر اسلاید همانند یک پروب (Probe) برای تشخیص بیان ژن عمل میکنند. به مولکول پروب DNA، ترانسکریپتوم (Transcriptome) نیز میگویند.
- پروب DNA، DNA تک رشتهای است که با هیبریداسیون (Hybridization) به شناسایی DNA مکمل هدف کمک میکند.
اسکنرهای میکرواری تجهیزات آزمایشگاهی هستند که به اندازهگیری نواحی فلورسنت میکرواری DNA کمک میکنند و اطلاعات مربوط به فعالیت هزاران ژن را آشکار میکنند. این اسکنرها به تعیین کیفیت بیان ژن یا بیان بیش از اندازه طبیعی ژنها در هنگام بروز بیماری خاص کمک میکنند.
طرز کار میکرواری
اصل اساسی میکرواری DNA عبارت است از “هیبریداسیون اسید نوکلئیک” (Nucleic acid hybridization). هیبریداسیون اسید نوکلئیک به معنای اتصال دو DNA مکمل توسط پیوندهای هیدروژنی برای تشکیل یک مولکول دو رشتهای است. طرز کار میکرواری شامل مراحل زیر میباشد:
-
آمادهسازی تراشه DNA
راههای زیادی برای آمادهسازی تراشه میکرواری وجود دارد. در ابتدا تراشه DNA با استفاده از روشهای فوتولیتوگرافی (Photolithographic) طراحی میشد. امروزه شیمی حساس به نور (Photoactivated chemistry) و پوششی (Masking) به دستیابی به پروبهای DNA کمک میکنند که البته برای خرید، به صورت تجاری نیز در دسترس هستند. همچنین یکی دیگر از راههای آمادهسازی تجاری موجود، یک پروب از قبل طراحی شده است که به یک سوزن ظریف، پرینت شده روی سطح ماتریس شیمیایی توسط یک روبات، متصل شده است.
-
هیبریداسیون اسید نوکلئیک
برای هیبریداسیون اسید نوکلئیک مراحل زیر انجام میشود:
-
- جمع آوری نمونه: تهیه دو نمونه از بافت سالم و همچنین بافت آلوده جهت مقایسه ترجیح داده میشود.
- ایزولهسازی RNA (ریبونوکلئیک اسید): mRNA را از نمونه جمع آوری شده با استفاده از روش ستون یا حلال ایزوله کنید.
- آمادهسازی cDNA نشاندار: cDNA نشاندار شده (DNA مکمل) را از RNAهای ایزوله شده تهیه کنید. نشانه گذاری با استفاده از رنگهای فلورسنت مانند Cy3 و Cy5 انجام میشود.
- هیبریداسیون: اکنون cDNAهای آماده شده و نشانه گذاری شده را در تراشههای DNA/ سینیهای میکرواری به همراه پروب مورد نیاز برای هیبریداسیون قرار دهید.
-
آنالیز تراشه DNA
یک اسکنر میکرواری به جمعآوری دادههای سینی تراشه/ میکرواری هیبرید شده پس از شستشوی کامل سینی برای حذف DNAهای غیرقابل پیوند یا هیبرید نشده، کمک میکند. شدت رنگ اندازهگیری میشود و تفاوت بین بافت سالم و آلوده به آنالیز ژنها کمک میکند.
اصول اسکنر میکرواری
لیزرهای اسکنر میکرواری، ژنهای نشاندار شده با فلورسنت را در سینی میکرواری تحریک میکنند. به علاوه، دوربین و میکروسکوپ به ایجاد تصویر ژنهای تحریک شده کمک میکنند. سپس یک برنامه به محاسبه نسبت رنگ قرمز به سبز یا کم کردن دادههای زمینهای برای هر اسپات در میکرواری با استفاده از تصویر دیجیتالی ژن هیبرید شده، کمک میکند.
اجزای اسکنر میکرواری
بخشهای اسکنر میکرواری به طور کلی به دو بخش طبقهبندی میشوند:
- اسکنر: از لیزر برای تحریک DNA هیبرید شده نشاندار شده و یک لوله فتومولتیپلایر (Photomultiplier) برای خواندن هر اسپات تراشه به صورت یکی یکی تشکیل شده است.
- تصویرگر (Imager): از یک لیزر برای تحریک DNA، یک دوربین و یک میکروسکوپ برای گرفتن تصویر از ژن تشکیل شده است.
- آنالایزر (Analyzer): نرمافزاری است که به آنالیز دادههای تولید شده پس از اسکن با مقایسه کنتراست رنگ، کمک میکند.
مزایای میکرواری
آنالیز نمونههای متعدد
از آنجایی که یک تراشه منفرد از هزاران اسپات برای هیبریداسیون DNA تشکیل شده است، یک تراشه واحد میتواند چندین نمونه را به طور همزمان آنالیز کند. همچنین در جداسازی سلولهای غیر سرطانی از سلولهای سرطانی مفید است.
یکپارچگی
تکنیک میکرواری به تولید دادههای منسجم کمک میکند، که این امر سرعت آنالیز را در مقایسه با سایر تکنیکهای هیبریداسیون اسید نوکلئیک افزایش میدهد.
آنالیز میکرو مقیاس
در مقایسه با سنجشهای معمولی، سطح یا مقیاس مورد استفاده در میکرواری حداقلی بوده، شناساگرها را کاهش داده، حجم تحقیقات را به حداقل رسانده و سرعت واکنش و غلظت نمونه را افزایش میدهد.
محدودیتهای میکرواری
کیفی بودن نتایج
نتیجه تولید شده توسط میکرواری معمولاً کیفی است. یعنی کمی کردن دادههای به دست آمده غیرممکن است.
نتایج غیر قابل تکرار
حتی اگر پروب مورد استفاده یکسان باشد، گاهی اوقات نتیجه ممکن است با نمونه اصلی متفاوت باشد. به طور مشابه، نظارت پس از رونویسی (Transcription) میتواند بر ترجمه تأثیر بگذارد.
برای پروتئینها و لیپیدها قابل استفاده نیست
بیشتر تکنیکهای بیان ژن جهت انطباق با شناسایی محصولات نهایی مانند پروتئینها و لیپیدها اصلاح شدهاند. با این حال، میکرواری فقط با تشخیص ژن/ DNA هدف قرار گرفته شده سر و کار دارد.
نحوه انتخاب یک اسکنر میکرواری
جهت انتخاب یک اسکنر میکرواری مناسب برای آزمایشگاه شما، تمام الزامات زیر باید بررسی شوند:
- حساسیت: حساسیت اسکنر میکرواری باید بالا باشد تا از بروز هرگونه خطای آنالیز DNA جلوگیری شود.
- وضوح: اسکنر میکرواری باید دارای دوربینی با وضوح خوب جهت بزرگنمایی تصویر میکروسکوپی باشد.
- محل اسکن: محل اسکن میکرواری به تعداد اسپاتهایی که معمولاً در آزمایشگاه شما آنالیز میشوند، بستگی دارد. احتمالاً انتخاب یک اسکنر با یک محل کمی بزرگتر از اسپاتهایی که عموما آنالیز میشوند، بهتر است، زیرا ممکن است تعداد نمونههای مورد آنالیز در آینده افزایش یابد.
- سرعت اسکن: سرعت اسکن در انتخاب اسکنر میکرواری مناسب برای آزمایشگاه شما بسیار تعیین کننده میباشد. انتخاب یک اسکنر میکرواری با بالاترین سرعت اسکن باید برای شما ارجح باشد زیرا سرعت تکمیل فرآیند میکرواری را تعیین میکند.
- ملاحظات دیگر: ملاحظات دیگری مانند اینکه چقدر استفاده از آن آسان است، آیا به چندین گزینه لیزر و فیلتر نیاز دارید و اینکه آیا با توجه به نیازهای آینده قابل ارتقا است نیز ضروری میباشد.
همچنین بخوانید:
- تجهیزات پزشکی آزمایشگاه تشخیص مولکولی
- کلنی کانتر: انواع، اساس، اجزا، موارد استفاده، مثال
- آنالایزر DNA: اصول کار، مراحل کار و موارد استفاده
مترجم: صادق حسینیکیا
