وسترن بلاتینگ – بخش سوم – دوبله ژنیران

شوسترن بلاتینگ، پارت سوم

Transfer, Blotting & Visualization

جهت بررسی ژل بیشتر برای تشخیص و تجسم پروتئین ها و یا مولکول های خاص، پروتئین ها از ژل به یک صفحه ای با ماندگاری بیشتر که می توان آن را دستکاری کرده و توسط آنتی بادی های مورد نظر بلاته کرد، منتقل و یا به عبارتی Transfer می شوند. Transfer کردن به جهت دسترسی آزاد آنتی بادی به پروتئین ها ضروری است چرا که ژل پلی آکریل آمید شکننده بوده و نمی توان زیاد آن را دستخوش تغییرات قرار داد. متد Transfer که عموما در وسترن بلاتینگ مورد استفاده قرار می گیرد روش electroelution می باشد. در این روش یک میدان الکتریکی به ژل اعمال می شود تا حرکت پروتئین ها به بیرون از ژل و به سمت غشاء تسهیل شود. در Transfer ژل پلی آکریل آمید در تماس مستقیم با غشائی از جنس نیتروسلولز و یا مواد غیرفعال دیگری که با پروتئین ها باند می دهند، قرار گرفته و سپس هر دو درون یک تانک پر شده از بافر گذاشته می شوند. ساندویچ Gel/Membrane به شکلی درون تانک الکتروفورز قرار می گیرند که الکترود منفی نزدیک به ژل و الکترود مثبت نزدیک به غشاء قرار می گیرد. زمانی که میدان الکتریکی درون تانک اعمال شود، پروتئین های ژل از انتهای منفی به سمت انتهای مثبت درون تانک حرکت می کنند. یعنی از ژل خارج شده و وارد غشاء می شوند و با غشاء اتصال محکم ایجاد می کنند. در مرحله بعدی غشاء با آنتی بادی که قرار است پروتئین مورد نظر، رزیجو های خاص و یا مدیفیکاسیون های شیمیایی را تشخیص دهد، تیمار می شود. غشاء هایی که برای وسترن بلاتینگ استفاده می شود تمایل بالایی نسبت پروتئین ها که شامل آنتی بادی ها نیز می شود دارند. بنابراین بسیار مهم است قبل از اینکه آنتی بادی به غشاء اضافه شوند، اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی به غشاء را به حداقل رساند. غشاء با محلولی که عموما شامل یک عامل بلوکه کننده مانند شیر خشک یا پروتئین خالص شده به همراه یک دترجنت ملایم است، انکوبه می شود. پروتئین هایی که درون عامل بلوکه کننده وجود دارند، به نواحی از غشاء متصل می شود که هنوز توسط پروتئین های الکتروفورز شده اشغال نشده اند. این کار مانع اتصال غیراختصاصی آنتی بادی ها در مراحل بعدی می شود. بعد از بلوکه کردن، غشاء درون محلولی شامل محلول بلوکه کننده و آنتی بادی اولیه که به شکل اختصاصی پروتئین مورد نظر را شناسایی می کند، انکوبه می شود. در ادامه انکوباسیون، غشاء با بافر های شست و شو و در شیکر الاکلنگی با دور کم پروسه شست و شو را طی می کند. بافر شست و شو شامل همان دترجنت ملایمی است که در محلول بلوکه کننده استفاده شده است که این بافر کمک موجب جدا شدن آنتی بادی های اولیه که به شکل غیر اختصاصی متصل شده اند، می شود. پس از شست و شوی غشاء جهت جدا کردن آنتی بادی اولیه غیر متصل، غشاء با آنتی بادی ثانویه انکوبه می شود. این کار موجب شناسایی آنتی بادی اولیه که استفاده شده است می شود. همانند انکوباسیون آنتی بادی اولیه، انکوباسیون آنتی بادی ثانویه در حضور محلول بلوکه کننده انجام شده و پس از آن سری شست و شو ها انجام می شود. آنتی بادی های ثانویه خود نیز از طرفی به یک reporter enzyme یا فلوئوروفور متصل است که جهت شناسایی نوری آنتی بادی اولیه و پروتئین مورد نظر می باشد. آنتی بادی ثانویه همچنین تشخیص نوری را افزایش می دهد چرا که چندین آنتی بادی ثانویه می توانند فقط به یک آنتی بادی اولیه متصل شوند.

معمول ترین نوع آنتی بادی ثانویه که برای وسترن بلاتینگ مورد استفاده قرار می گیرد، نوع متصل به آنزیم Horseradish Peroxidase می باشد. آنزیم Horseradish Peroxidase واکنش تولید نور را به عنوان یک محصول جانبی کاتالیز می کند. میزان نور تولید شده مستقیماً متناسب با میزان آنتی بادی های ثانویه متصل به Horseradish Peroxidase می باشد. سیگنال نوری یک محصول گذرا بوده و فقط زمانی که واکنش در حال انجام است ظاهر می شود. معمول ترین روش برای بررسی نوری استفاده از فیلم مخصوص اشعه X می باشد. پس از اضافه کردن سوبسترا آنزیم Horseradish Peroxidase، اشعه X دقیقا بالای غشاء قرار می گیرد. افزایش تایم در معرض اشعه X قرار گرفتن فیلم موجب تولید سیگنال های قوی تری می شود اما از طرفی باعث افزایش سیگنال در پس زمینه نیز می شود.

همچنین محققان دنبال پروتئین هایی هستند که میزان آن ها در نمونه های مورد آزمایش ثابت باقی می ماند تا ثابت کنند که محتوای کلی پروتئین ها در تمامی نمونه ها مشابه است. برای انجام اینکار محققان می توانند دو ژل مختلف را ران کرده و یا غشای موجود را از آنتی بادی ها عاری کرده و از آن دوباره استفاده کنند. آنتی بادی زدایی غشاء توسط انکوباسیون غشاء در دما های بالا همراه با Stripping Buffer که شامل SDS و بتامرکاپتواتانول می باشد، انجام می شود. در آزمایشگاه آنتی بادی زدایی نمی تواند بیش از دو یا سه بار انجام شود و در صورت تکرار بیش از اندازه پروتئین های مورد نظر که به غشاء متصل هستند نیز جدا شده و موجب تضعیف سیگنال می شود.

همچنین از صفحات زیر دیدن فرمایید:
کارآموزی ژنتیک مهندسی ژنتیک و کلونینگ
خدمات و تجهیزات آزمایشگاهی مهندسی ژنتیک و کلونینگ 
مطالب علمی بیشتری را در ویکی ژن مطالعه فرمایید…

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه

3 / 5. تعداد رای دهندگان: 4

تا حالا امتیازی برای این مطلب ثبت نشده؛ با ثبت نظرتون مارو خوشحال می‌کنید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *